單寧酸-魚明膠共價、非共價相互作用 復合物抗氧化活性比較研究

◎ 郭揚凱，趙 利，白春清

（1.江西科技師范大學生命科學學院，江西 南昌 330013；2.江西科技師范大學有機功能分子研究所，江西 南昌 330013）

明膠是一種極其重要的結構蛋白，可由膠原蛋白水解得到，廣泛存在于動物的軟骨、韌帶、肌膜、皮膚中[1]，其提取制品因具有良好的保濕性、乳化性及成膜性已廣泛應用于醫藥、保健、食品加工、化妝品等領域[2]。由于魚鱗中含有大量的膠原蛋白，且近些年來瘋牛病、口蹄疫等傳染性疾病的發生和盛行，人們對來源于牲口的明膠的安全性產生了懷疑[3]，所以研究和開發魚鱗等水產品加工廢棄物中魚明膠逐漸受到人們的重視。但以魚為原料提取得到的魚明膠制品普遍存在溶解度低、抗氧化活性及乳化性不理想等問題，限制了其在食品工業中的進一步應用。科學研究表明，多酚可以進入蛋白質分子的內部，且可以與肽鏈以非共價鍵或共價鍵鏈接[4]，改變蛋白質的結構，進而影響其功能特性。大量實驗證明多酚與蛋白質共價鍵鏈接可以提高蛋白質的抗氧化活性、熱穩定性以及乳化活性[5]。單寧酸是公認的安全食品添加劑，可廣泛用于烘焙食品、飲料，乳制品及糖果中，因含有足夠的羥基和羧基，可以與蛋白質作用形成復雜的聚合物[6]。當前，關于單寧酸與其他來源蛋白質相互作用的研究較多，而其與淡水魚明膠間的相互作用報道較少。因此，本研究擬以抗氧化活性為指標，評價不同形式明膠-單寧酸結合方式對明膠功能特性的改善效果，為魚明膠的改性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚明膠、95%乙醇溶液、3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼試劑（DPPH），上海國藥集團化學試劑有限公司生產；單寧酸（95%）、過硫酸鉀、8-苯胺-1-萘磺酸，湖北信康醫藥化工有限公司生產；啡啰嗪，長春匯力生物技術有限公司生產。

1.2 儀器與設備

UV-1800紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司生產；BSA224S-CW型電子天平，德國賽多利斯公司生產；HH-600型恒溫水浴鍋，青島聚創世紀環保科技有限公司生產。

1.3 氧化單寧酸-明膠共價結合物（OTA-G）的制備

稱取一定量的明膠，溶于水制備濃度為1.2%的蛋白溶液，用1 mol·L-1NaOH調整體系pH至9.0。向單寧酸溶液中加入蒸餾水溶解至濃度為2%，然后用 1 mol·L-1NaOH調pH至9.0，40 ℃吹氧氣1 h將單寧酸（TA）氧化為氧化單寧酸（OTA）。75 mL明膠溶液與2.25 mL OTA溶液進行混合，并加水至蛋白濃度為1%。將此混合物室溫磁力攪拌12 h后透析除去游離的OTA和明膠。

1.4 單寧酸-明膠非共價結合物（TA-G）

按照類似1.3的步驟制備單寧-明膠價非共價結合物，區別為體系pH為7.0，且TA無需加氧反應。

1.5 抗氧化活性測定

以明膠為對照，分別采用以下幾種方法測定單寧酸-明膠結合物的抗氧化活性。

1.5.1 DPPH自由基清除實驗

取樣品1.5 mL與0.10 mmol·L-11，1-二苯基-2-三 硝基苯肼（DPPH）的95%乙醇溶液1.5 mL超聲 5 min，充分搖晃，在暗處靜置0.5 h。同樣方法做空白樣品，在517 nm處測定樣品吸光度。

1.5.2 ABTS自由基清除率測定

7.4 mmol·L-12，2’-疊氮雜環（3-乙基苯并噻唑 啉-6磺酸）（ABTS）[7]與過硫酸鉀（2.6 mmol·L-1）按體積比1∶1（v/v）混合，室溫放置12 h制備ABTS工作液。將ABTS工作液與甲醇進行混合稀釋，直至吸光度在734 nm處吸光度為1.1±0.02，即可得ABTS工作液。取150 μL樣品與2850 μL ABTS工作液進行混合、渦旋，在暗處放置2 h后，在734 nm處測量樣品對ABTS的猝滅效果。其活性以μmol-TE/g蛋白表達。

1.5.3 鐵還原力測定（FRAP）

用0.3 mol·L-1pH3.6的醋酸緩沖液、10 mmol·L-1三吡啶基三嗪（TPTZ）[8]溶液與20 mmol·L-1FeCl3溶液以10∶1∶1的比例混合可得FRAP溶液。取新制備的2.85 mL FRAP溶液在37 ℃條件下預熱30 min，然后與150 mL樣品混合，混合物在室溫下暗處反應0.5 h后，測定樣品在593 nm處的吸光度。同時用蒸餾水代替樣品溶液進行反應作為樣品空白。FRAP表達為μmol-TE/g蛋白。

1.5.4 Fe2+螯合率的測定

取樣品（4.7 mL）于試管中加入0.1 mL 2 mmol·L-1FeCl2和0.2 mL 5mmol·L-1啡啰嗪[9]，混勻后，黑暗處靜置20 min。然后同時用蒸餾水代替樣品溶液進行反應作為樣品空白。在562 nm處測定樣品吸光度。

1.6 數據分析

所有實驗在操作時進行5個平行實驗，以防誤差，結果以平均值±ds表示。

2 結果與分析

2.1 DPPH自由基清除實驗

單寧酸作為抗氧化劑，因含有大量的羥基，而具有有著較強的DPPH自由基清除能力。從圖1可發現，魚明膠與氧化單寧酸共價相互作用后ORAC值為80.59 μmol-TE/g，非共價相互作用后ORAC值為85.32 μmol-TE/g，分別約為抗氧化劑單寧酸抗氧化能力的65.51%和61.88%，且都顯著高于魚明膠的測定值。上述結果，一方面說明單寧酸與魚明膠間的相互作用可以改善魚明膠的自由基清除能力，從而提高魚明膠的還原性；另一方面，說明被改性的魚明膠抗氧化能力的高低很大程度上取決于與單寧酸的結合形式。TA-G通過非共價相互作用完成單寧酸對明膠的改性，因此，單寧酸的結合率較高，同等條件下明膠分子中可引入更多的單寧酸，而單寧酸的羥基可向明膠提供大量的氫原子，以提高明膠的抗氧化活性，致使TA-G自由基清除率高于OTA-G。

圖1 DPPH自由基清除能力圖

2.2 ABTS自由基清除率測定

TA和OTA改性明膠對ABTS自由基清除活性如圖2所示。整體來說，樣品的ABTS自由基清除活性與其對DPPH自由基清除活性基本一致。改性明膠對ABTS自由基的清除率高于明膠對照組，但其活性卻低于游離單寧酸。單寧酸具有較強的抗氧化活性，在其對明膠進行改性的過程中，可有效清除體系自由基，形成更穩定的結合產物，而終止了自由基連鎖反應[7-8]。然而，在結合過程中，單寧酸的羥基有所減少，導致其抗氧化活性低于游離單寧酸。與TA改性明膠相比，OTA改性明膠的ABTS自由基清除活性較低，可能是因為OTA為氧化型，其與明膠結合后，失去了抑制自由基的能力。

圖2 ABTS自由基清除能力圖

2.3 多酚-魚明膠相互作用對鐵還原力的影響

在酸性條件下Fe3+可以被多酚還原為Fe2+，與TPTZ絡合形成藍紫色溶液。測定在593 nm波長處的熒光強度，即可作為樣本總抗氧化能力的指標。對鐵的還原力越大說明抗氧化性越強。從圖3中可以看出，單寧酸對鐵的還原能力最強，展現了其較強的還原能力；明膠經單寧酸共價修飾和非共價修飾明膠后對鐵的還原能力都顯著高于對照組，說明單寧酸與魚明膠的結合可提高明膠的抗氧化活性。雖然，非共價修飾明膠對鐵離子的還原能力顯著高于共價修飾明膠，且低于游離單寧酸，但整體來說與DPPH、ABTS自由基清除率結果一致。

圖3 樣品對鐵還原率的測定圖

2.4 多酚-魚明膠相互作用對Fe2+螯合率的影響

亞鐵離子（Fe2+）是作為重要的金屬離子促氧化劑之一，通過催化活性氧、羥基自由基（OH·）的生產，引發脂質氧化鏈式反應[9]。相同條件下，Fe2+螯合率越大說明抗氧化劑的抗氧化性越強。由圖4可知，魚明膠與單寧酸自身都可以與Fe2+螯合，明膠改性后對Fe2+螯合率有所提高，且高于游離單寧酸的測定值。可能明膠分子中帶負電的羧基與Fe2+間的靜電相互作用提高了結合物的螯合能力。

3 結論

單寧酸與魚明膠結合會提高魚明膠的抗氧化活性，且單寧酸-魚明膠以非共價鍵結合時抗氧化能力更為強烈。因此在以后的食品加工過程中，可以用單寧酸對魚明膠進行改性，以便更合理的利用魚明膠的特性。本研究將填補單寧酸對魚明膠相互作用研究的理論空白。