水產品中硝基呋喃類代謝物殘留檢測能力驗證

◎ 李文杰，倪建秀，張 聰，陳 濤，陳桂芳

（南京市農產品質量檢測院，江蘇 南京 210036）

能力驗證是依據預先制定的準則，采用檢驗檢測機構間比對的方式，評價參加者的能力[1]，它是確保實驗室維持較高的校準和檢測水平而對其能力進行考核、監督和確認的一種驗證活動。參加能力驗證計劃，可以為實驗室提供評價其出具數據可靠性和有效性的客觀證據。硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗菌藥物，由于其價格低廉、抗菌效果好，曾經被廣泛應用于水產等動物傳染病的預防和治療。但由于該類抗生素及其代謝物有致畸胎、致突變和致癌的危險[2-3]，因此此類藥物已先后被禁止在治療和飼料中使用[4]，但仍有文獻報道在水產養殖過程中被使用[5]。近年來，農業部、地方政府組織實施一系列城市例行監測、產地監督抽查、苗種監督抽查、風險預警等各類抽檢工作，以保證水產品質量安全。因硝基呋喃類原型藥在生物體內代謝迅速[6]，其代謝產物因和蛋白質結合而保證長時間穩定存在，所以一般以硝基呋喃類藥物代謝物為目標分析物，來達到檢測硝基呋喃類藥物殘留量的目的。硝基呋喃類代謝物殘留量測定常用的方法有液相色譜法[7]、液相色譜-串聯質譜法[8-11]。為加強實驗室的規范管理，提高檢驗檢測技術水平，本實驗室近年來多次參加部省級能力驗證。本文以參加2016年農業部辦公廳組織的水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量能力驗證[12]為例，采用《水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》（農業部783號公告-1-2006），對水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量進行測定，以評價檢測數據的可靠性和有效性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6460C超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀（配有ESI離子源，Agilent公司）、Allegra X-30R 臺式高速冷凍離心機（貝克曼公司）、KS 501振蕩器（IKA公司）、BP211D電子天平（感量0.000 01 g，賽多利斯公司）、PL602E電子天平（感量0.01 g，梅特勒公司）、MV5全自動濃縮儀（萊伯泰科公司）、Synergy超純水儀（默克密理博公司）及0.45 μm GHP萬用膜針式過濾器（Pall公司）。

呋喃唑酮代謝物（AOZ）標準品，純度99.7%，德國Witega公司生產；呋喃它酮代謝物（AMOZ）標準品，純度99.5%，德國Witega公司生產；呋喃西林代謝物（SEM）標準品，純度99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司生產；呋喃妥因代謝物（AHD）標準品，純度99.7%，德國Dr.Ehrenstorfer公司生產；同位素內標AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM-13C-15N2， 德國Witega公司生產；甲醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜，色譜純，Tedia公司生產；2-硝基苯甲醛，Sigma-aldrich公司生產；實驗用水為Millipore系統所制超純水。

準確稱取上述適量的標準品，用甲醇分別配制成100 μg·mL-1的標準貯備液，再準確吸取AOZ、AMOZ、SEM、AHD相應的體積用甲醇配制成50 ng·mL-1混合標準工作液，吸取AOZ-D4，AMOZ-D5，AHD-13C3，SEM-13C-15N2相應的體積用甲醇配制成50 ng·mL-1混合內標標準工作液，標準溶液均置于-20 ℃保存。

0.2 mol·L-1鹽酸溶液：量取濃鹽酸（ρ=1.19 g·mL-1）1.67 mL用水稀釋至100 mL。

0.05 mol·L-12-硝基苯甲醛溶液：稱取0.0378 g 2-硝基苯甲醛溶液溶于5 mL二甲基亞砜中，現用現配。

1.0 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液：稱取87.1 g磷酸氫二鉀溶液，溶解于500 mL水中。

能力驗證樣品：由能力驗證技術支持單位中國水產科學研究院提供，樣品編號：X46。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

稱取2.0 g（精確至0.01 g）相同基質空白樣品于50 mL離心管中，加入50 ng·mL-1混合內標標準溶液 0.08 mL和50 ng·mL-1混合標準工作液0.04 mL和 0.08 mL，渦旋混合50 s，再加入5 mL鹽酸溶液和 0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋振蕩50 s，置于恒溫水浴振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。

取出離心管冷卻至室溫，加入5 mL磷酸氫二鉀溶液，調節pH至7.0～7.5，加入4 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩5 min，6 000 r·min-1，20 ℃離心5 min，取上清液轉移至10 mL離心管中，再加入4 mL乙酸乙酯重復上述操作，合并上清液于40 ℃下氮氣吹干。準確加入1.0 mL甲醇∶水（2 mmol·L-1乙酸銨+0.1%甲酸）（2∶8，V/V）渦旋振蕩30 s，樣液經0.45 μm濾膜，供液相色譜-串聯質譜測定。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm， 1.8 μm）；流動相：A為水（含2 mmol·L-1乙酸銨+0.1%甲酸），B為甲醇；梯度洗脫：0～3 min，80%→30%A，3～11min，30%→10%，11～11.01 min， 10%→80%；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

1.2.3 質譜條件

離子源：電噴霧ESI，正離子模式；霧化氣：氮氣；離子噴霧電壓：4 000 V；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：11 L·min-1；霧化氣壓力：45 psi；掃描方式：多反應監測MRM。離子對、質譜采集參數見表1。

表1 硝基呋喃類代謝物MRM質譜參數表

2 結果與分析

2.1 低濃度特征離子色譜圖和線性范圍

精密量取5 ng·mL-1混合標準工作液0.10 mL、 0.20 mL、0.40 mL和50 ng·mL-1混合標準工作液0.08 mL、0.16 mL、0.20 mL、0.40 mL于7個50 mL離心管中，除不加樣品外，按上述步驟操作。配制成質量濃度分別為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、 8.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的硝基呋喃類代謝物標準工作液，內標濃度為4 ng·mL-1，以分析物的相對響應值（分析物與內標的峰面積比）為縱坐標，相對濃度（分析物與內標的濃度比）為橫坐標，繪制標準曲線，低濃度標準溶液特征離子色譜圖見圖1。 結果表明，硝基呋喃類代謝物在0.5～20 ng·mL-1范圍內具有良好的線性關系，見圖2。

圖1 低濃度標準溶液特征離子色譜圖

2.2 質控樣的回收率和精密度

向 空 白 試 樣 中 添 加1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1的2個不同濃度的混合標準工作液，每個濃度3個平行，按照1.2方法進行添加回收試驗。結果顯示，本方法在1.0～2.0 μg·kg-1添加范圍內，回收率范圍為93.4%～107.5%，相對標準偏差為1.0%～8.2%，空白基質中添加4種藥物回收率及精密度結果見 表2。

2.3 能力驗證樣品中硝基呋喃類代謝物的含量

根據線性回歸方程計算各組分濃度，SEM未檢出，AOZ、AMOZ和AHD含量分別為3.17 μg·kg-1、 2.49 μg·kg-1和1.58 μg·kg-1（見表3）。

圖2 4種藥物擬合曲線圖

表2 空白基質中添加4種藥物回收率及精密度表

表3 能力驗證樣品4種藥物含量表

3 結論

本次能力驗證結果判定為合格的標準為回收率70.00%～120.00%[12]。AOZ、AMOZ和AHD的回收率分別為96.06%、103.75%和87.78%，能力驗證結果判定合格。