卵黃替代血清檢測(cè)蛋雞H5、H7免疫抗體試驗(yàn)

厲磊 秦燕 劉維紅 王冠東 邵春雷 王雷之

（山東省臨沂市畜牧發(fā)展促進(jìn)中心 276000）

臨沂市是畜牧業(yè)大市，其中蛋雞養(yǎng)殖是部分農(nóng)民發(fā)家致富的重要手段。禽流感是由A 型禽流感病毒引起的一種高度接觸性、急性傳染病。H5、H7亞型高致病性禽流感給養(yǎng)禽業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，被我國(guó)列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。2004 年，我國(guó)開(kāi)始對(duì)H5亞型高致病性禽流感實(shí)施強(qiáng)制免疫政策，2017 年又對(duì)H7亞型實(shí)行強(qiáng)制免疫。如何評(píng)價(jià)疫苗免疫效果尤為重要。每年本市根據(jù)省獸醫(yī)主管部門(mén)（省畜牧獸醫(yī)局）動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃下達(dá)本行政區(qū)域的動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃。雞高致病性禽流感免疫效果的監(jiān)測(cè)，需要按一定比例采樣，抽取雞血析出血清后，做血凝和血凝抑制試驗(yàn)來(lái)判定結(jié)果。采取雞血需要專業(yè)技術(shù)人員操作，并且需要采取必要的防護(hù)隔離措施，消耗大量的人力、物力。并且捉雞、采血使雞產(chǎn)生較大的應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋有一定的影響。母雞以特定抗原免疫后，能產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的特應(yīng)性抗體，抗體除存在于血清中外，還可以儲(chǔ)存于卵黃中，稱為卵黃抗體。因此，卵黃抗體與血清抗體應(yīng)存在一定的相關(guān)性，若能收集蛋樣檢測(cè)卵黃抗體，則可以減少雞群采血應(yīng)激[1]，而且操作更為方便。鑒于此，本中心于2019 年10～12 月，選擇了部分蛋雞場(chǎng)進(jìn)行高致病性禽流感免疫注射和抗體水平檢測(cè)，并對(duì)血清抗體效價(jià)和卵黃抗體效價(jià)進(jìn)行了比較分析，為生產(chǎn)實(shí)踐中產(chǎn)蛋雞卵黃抗體檢測(cè)H5、H7亞型禽流感免疫抗體提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在蘭山區(qū)、河?xùn)|區(qū)選擇6 個(gè)蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)，日齡均在180～190 日齡。

1.1.2 疫苗

重組禽流感（H5、H7）三價(jià)滅活疫苗（H5N1Re-11 株+Re-12 株、H7H9），哈藥集團(tuán)生物疫苗生物疫苗有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 檢測(cè)試劑

H5亞型（Re-11 株、Re-12 株）禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原及陽(yáng)性血清，H7H9亞型禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原及陽(yáng)性血清，均為哈爾濱維科生物科技開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品，均在有效期內(nèi)。

1.1.4 試劑

pH7.2 0.01mol/L PBS、1%雞紅細(xì)胞懸液均按照 《GB/T 18936-2003 高致病性禽流感診斷技術(shù)》 要求配置。

1.1.5 試驗(yàn)器材

96 孔v 型微量反應(yīng)板、單道、8 道移液器(品牌BRAND)、加樣吸頭、離心機(jī)、振蕩器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 疫苗注射

選6 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)分別注射重組禽流感（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗。

1.2.2 樣品采集

注射疫苗后14、21、28、40、50、60d 分別對(duì)應(yīng)采集同一只雞血清和雞蛋。每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集雞30 份。

1.2.3 樣品處理

血清樣品：無(wú)菌翅靜脈采血，室溫放置待血液凝固自然析出血清，必要時(shí)用低速（1500～2000r/min）離心5～10min，分離血清。

卵黃樣品：雞蛋清潔消毒，磕開(kāi)瀝出蛋清，只留蛋黃在半邊蛋殼中。在樣品管中加入0.5mlPBS 液，再吸取0.5ml 卵黃做1:1 稀釋，振蕩器上混勻制成卵黃檢樣備用。

1.2.4 HI 抗體效價(jià)測(cè)定

取待檢血清樣品和卵黃樣品，按照GB/T 18936-2003 血凝（HA）試驗(yàn)和血凝抑制(HI) 試驗(yàn)進(jìn)行H5、H7亞型禽流感免疫抗體檢測(cè)。

2 檢測(cè)結(jié)果

抗體HI 效價(jià)平均值統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1、表2、表3。

3 分析與討論

由表1、表2、表3 可知，疫苗免疫14～60d，H5、H7亞型禽流感抗體，卵黃抗體與血清中的抗體水平同升同降，免疫后40d 均達(dá)到最高值，說(shuō)明二者的HI 抗體效價(jià)具有較強(qiáng)的相關(guān)性。

疫苗免疫14～28d，H5、H7亞型禽流感免疫抗體水平逐漸上升，但卵黃樣品的HI 效價(jià)比血清樣品的HI 效價(jià)低1～2 個(gè)滴度，這主要是因?yàn)榭贵w是由血液傳遞到卵黃的，卵黃的形成需要一定時(shí)間，所以卵黃抗體較血清抗體的檢測(cè)結(jié)果相比有一定滯后性[2]。

免疫28～60d，卵黃與血清樣品的禽流感抗體HI 效價(jià)（平均）基本一致，差異不顯著（＞0.05）。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋雞免疫重組禽流感三價(jià)疫苗28d 后，卵黃與血清抗體水平差異不顯著，具有較強(qiáng)的相關(guān)性，可以用卵黃代替血清進(jìn)行禽流感免疫抗體檢測(cè)，應(yīng)選擇在免疫28d 后。

用雞蛋檢測(cè)高致病性禽流感免疫抗體，采樣不需要專業(yè)技術(shù)，沒(méi)有外人進(jìn)入、不用捉雞、采血，對(duì)雞不會(huì)造成任何應(yīng)激，不會(huì)影響家禽的健康和生產(chǎn)性能，很好地緩解了養(yǎng)殖場(chǎng)戶對(duì)采樣的抵觸情緒，有利于免疫監(jiān)測(cè)的順利進(jìn)行。

表1 H5亞型Re-11 禽流感抗體HI 效價(jià)（平均）檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(log2)

表2 H5亞型Re-12 禽流感抗體HI 效價(jià)（平均）檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(log2)

表3 H7亞型禽流感抗體HI 效價(jià)（平均）檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(log2)