電針對失神經骨骼肌萎縮大鼠自噬相關因子的影響

王曉玲,范曉艷,趙俊龍,劉麗華,李惠

(1.渭南市中心醫院,渭南 714000;2.陜西省康復醫院,西安 710065;3.成都市溫江區中醫醫院,成都 611130)

骨骼肌約占體質量的 40%,在氨基酸和葡萄糖代謝、蛋白質的儲存和運動中發揮作用,骨骼肌的神經支配在決定肌肉結構和功能方面起著至關重要的作用[1]。失神經不僅導致肌肉萎縮和復雜的級聯反應,而且預后很差,甚至會增加死亡率。完全失神經后,骨骼肌沒有收縮活動,肌肉纖維迅速萎縮,肌肉質量喪失,導致功能受損[2]。研究認為萎縮肌肉中自噬負責在溶酶體中降解所有活細胞中不必要的或功能失調的細胞器和蛋白質,由此產生的分解產物會產生新的能量來維持細胞和組織的健康[3]。電刺激、伸展和強化運動等,被廣泛用于神經再支配發生之前防止失神經肌肉萎縮[4]。電針作為有效緩解失神經骨骼肌萎縮的一種方法,被認為可有效促進周圍神經損傷后功能的恢復及改善神經損傷的癥狀[5]。因此,本研究探討電針對失神經骨骼肌萎縮大鼠自噬相關因子的影響,以期為失神經骨骼肌萎縮治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康SD雄性大鼠30只,體質量(260±10)g,8周齡,購自成都碩達實驗動物有限公司,生產許可證號SCXK(川)2019-031,使用許可證號 SYXK(川)2018-119。大鼠適應性飼養1周,隨機分為假手術組、模型組、電針組,每組10只。

1.2 主要試劑和儀器

HE染色試劑盒(上海碧云天生物),蛋白裂解試劑盒(江蘇凱基生物),PCR引物(上海生工),RNA Miniprep試劑盒(上海西寶生物),總RNA提取試劑(北京天根),p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1抗體(英國Abcam),華佗牌電針儀SDZ-V型(蘇州醫療用品廠),凝膠成像系統(美國Bio-Rad)。

1.3 模型制備

通過暴露并切斷坐骨神經的方法制作失神經性腓腸肌萎縮動物模型。具體方法[6]為采用2.5%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉大鼠,將大鼠固定,充分暴露大鼠右后肢,使用已高壓消毒的手術器械沿臀大肌間隙鈍性分離、暴露坐骨神經,剝離坐骨神經后,用手術剪將模型組與電針組的大鼠坐骨神經中段切斷,同時使兩游離段反折產生2.0 mm的神經缺損,而假手術組只暴露但不切斷坐骨神經。

1.4 電針干預

造模后第2天開始,每日9: 00將電針組的大鼠固定于柔軟型大鼠固定器上,電針術側足三里、承山兩穴,針刺深度為5～7 mm,每日1次,每次10 min。穴位定位參照《大鼠穴位圖譜的研制》以及李忠仁主編的《實驗針灸學》[7];電針參數參考文獻[8],強度1.5 mA疏波,頻率為 5 Hz,以大鼠下肢稍震動為宜。為了避免強制固定時所導致的應激反應誤差,假手術組和模型組每日只固定不做任何處理,連續21 d。

1.5 樣本采集

實驗過程中,電針組大鼠死亡2只,模型組和假手術組未出現死亡,樣本采集過程中模型組和假手術組隨機剔除 2只大鼠,樣本均按每組8只采集分析。經2.5%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)將大鼠麻醉,迅速剝離雙側腓腸肌,稱重,保留術側腓腸肌,迅速采用 PBS緩沖液沖洗后,分 2部分,一部分采用多聚甲醛,一部分﹣80 ℃冰箱保存,待測。

1.6 觀察指標

1.6.1 各組大鼠腓腸肌濕重比計算

取材時用電子天平稱重并記錄雙側腓腸肌濕重,計算腓腸肌濕重比為(術側肌濕重/健側肌濕重)×100%。

1.6.2 腓腸肌組織病理觀察

HE染色,腓腸肌組織石蠟包埋,切片(約3～5 μm),脫水,蘇木精染色,后用伊紅染色,然后用乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性橡膠密封,顯微鏡下觀察組織形態學變化。Masson染色,常規石蠟切片脫蠟至水洗,酸性高錳酸鉀氧化,沖洗,草酸漂白,沖洗后放入蒸餾水中洗滌,用變色酸2R試劑染色,冰醋酸洗滌,磷鎢酸分化,傾去余液放入 1%～2%苯胺藍染色,再用冰醋酸水洗滌,封片,鏡檢觀察。

1.6.3 Western blot檢測

采用裂解試劑盒從腓腸肌中提取蛋白,總蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,然后將蛋白轉移到PVDF膜,用5%的脫脂牛奶溶于 Tris-Buffered生理鹽水(TBS)進行封閉。將膜與下列一抗在4 ℃下孵育過夜,p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1(均1:1 000)。經3次洗滌后,在37 ℃孵育2 h,用辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠抗體孵育。取出聚偏氟乙烯膜,化學發光法獲得膠片后進行圖像采集,目標條帶A值采用Quantity One凝膠圖像軟件分析,結果以p62、Beclin-1與β-actin INT值的比值及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ INT值的比值進行分析。

1.6.4 qRT-PCR檢測

采用總 RNA Miniprep試劑盒從腓腸肌中提取總RNA,用逆轉錄酶合成cDNA,采用TaqMan miRNA檢測試劑盒進行 qRT-PCR。以 GAPDH 作為內參,用 2-??CT分析相關基因表達。qPCR引物為Beclin-1,正向5'-GCTCCT ATTCCATCAAAACCCA-3',反向 5'-GTGAGGACACCCAAGCAA GAC-3';Vps34,正向5'-GAAAATATGGCATGTT TCGCC-3',反向5'-GTTCGTGTGGGTTCGGAGC-3';LC3,正向5'-AGAG CGATACAAGGGTGAGAAGC-3',反向 5'-CAGGAGGAAGAAGGC TTGGTTAG-3';GAPDH,正向5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTC GTAT-3',反向5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。

1.7 統計學分析

采用SPSS20.0軟件進行統計處理。符合正態分布的數據以均數±標準差表示,組間比較采用單因素方差統計分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腓腸肌濕重比變化

與假手術組相比,模型組腓腸肌濕重比明顯降低(P＜0.01);與模型組相比,電針組的腓腸肌濕重比明顯升高(P＜0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠腓腸肌濕重比變化

2.2 各組大鼠腓腸肌組織形態學變化

HE染色,假手術組肌肉組織內肌纖維排列較整齊,肌束結構較清晰,呈扁圓形或橢圓形,核位于邊緣,肌纖維胞質染色較均勻;肌間可見豐富的血管、神經等分布;局部肌纖維排列較稀疏,肌束大小不一,未見明顯纖維組織增生。模型組肌肉組織內部分肌纖維嚴重萎縮變形,體積變小,細胞壞死或溶解;肌間較多纖維組織增生。電針組肌肉組織內少量肌纖維輕微萎縮;肌間少量纖維組織增生(圖1)。

Masson染色,假手術組腓腸肌肌纖維排列整齊且形態較規則,并無明顯萎縮。模型組與電針組術側腓腸肌萎縮明顯,其形態較假手術組明顯縮小,膠原纖維逐漸增多且肌纖維間距因膠原纖維的增生而變寬。但電針組與模型組相比,腓腸肌萎縮明顯減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠腓腸肌組織形態學變化(×400)

2.3 各組大鼠腓腸肌組織 p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白水平比較

與假手術組比較,模型組 p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白水平升高(P＜0.05,P＜0.01);與模型組比較,電針組 Beclin-1蛋白水平降低(P＜0.05),p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平無明顯變化(P＞0.05)(圖2)。

圖2 各組大鼠腓腸肌組織p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1水平

2.4 各組大鼠腓腸肌組織 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA水平比較

與假手術組比較,模型組 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA水平升高(P＜0.05,P＜0.01);與模型組比較,電針組Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA水平降低(P＜0.05)。詳見表2。

表 2 各組大鼠腓腸肌組織 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA水平比較 (±s)

表 2 各組大鼠腓腸肌組織 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA水平比較 (±s)

注:與假手術組比較 1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較 3)P＜0.05

組別 n Beclin-1 Vps34 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ假手術組 8 1.01±0.19 1.01±0.13 1.00±0.09模型組 8 1.54±0.211) 1.97±0.422) 1.46±0.152)電針組 8 1.17±0.103) 1.39±0.173) 1.18±0.133)

3 討論

失神經導致肌肉質量下降,肌肉纖維橫截面積減少,肌力產生減少,肌周和肌內結締組織增多,這一階段之后是進行性的肌肉纖維壞死和凋亡,肌肉被纖維結締組織和脂肪取代[9]。通過加速目標肌肉的軸突再生和減緩萎縮的進程,從而提高肌肉的功能,可以改善神經損傷和修復后的運動恢復。研究指出神經修復后在神經再生過程中進行肌肉電刺激可以最大限度地減少失神經期間的肌肉萎縮[10]。在失神經肌肉中使用電刺激治療,結締組織含量減少,肌肉纖維面積增加[11]。此外,電刺激可明顯改善肌肉機械性能[12]。本研究結果顯示,電針組的腓腸肌濕重比明顯高于模型組,電針組肌肉組織內少量肌纖維輕微萎縮,肌間少量纖維組織增生,腓腸肌萎縮明顯低于模型組。與上述報道一致,表明電針可以有效延緩失神經骨骼肌萎縮進程。

自噬是細胞降解、自我消化及維持內環境穩定的重要機制。通過自噬選擇性地處理有缺陷的細胞成分可以在衰老過程中保護許多組織的細胞功能[13]。肌纖維萎縮的典型原因是蛋白質合成減少和蛋白質降解增加,這主要是由泛素-蛋白酶體系統的活性和自噬決定的[14]。骨骼肌中自噬的過度活化會加重肌肉萎縮,但抑制自噬會導致肌肉無力、萎縮、肌纖維變性,在去神經時抑制自噬會加劇肌肉質量損失,受損蛋白質和細胞器的積累從而影響組織的維持。自噬在幼鼠肌肉中的誘導會導致肌纖維萎縮,肌肉質量下降,肌肉力量成比例下降[15]。此外,趙偉等[16]報道提示電針可能通過促進自噬來延緩肌萎縮。自噬相關基因Beclin-1能介導其他自噬蛋白質定位于自噬前體,Vps34可與Beclin1、Vps15形成Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶復合物,在自噬體形成早期發揮重要的作用[17]。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ被認為是檢測自噬的重要指標之一,LC3參與了自噬體膜的形成,細胞內LC3經過Atg4加工成為胞漿可溶形式LC3Ⅰ,LC3Ⅰ再經Atg3、Atg7的作用,與自噬體膜上的PE結合成為 LC3Ⅱ,促進了自噬體膜的延伸,可追蹤自噬的整個過程,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可以反映出自噬的活性[18]。研究[17]發現亮氨酸的抗萎縮作用依賴于 Vps34活性,文獻[19]報道電針干預可能通過抑制自噬相關基因Beclin1、Atg5等表達,從而維持骨骼肌細胞穩態,延緩失神經骨骼肌萎縮。此外,研究[18]發現CSRP3沉默可抑制自噬相關LC3和Beclin-1蛋白的積累,從而使成肌細胞自噬受損。本研究表明模型組p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1 蛋白水平及 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA表達較假手術組升高,電針組Beclin-1蛋白水平及Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ mRNA表達較模型組降低。研究結果與文獻[16]報道不一致,可能是由于自噬的過度激活會造成肌肉萎縮,研究結果與文獻[19]報道一致,說明自噬活性在大鼠失神經后升高,肌肉在早期可能進行自我修復,電針干預后促進細胞自噬活性增強的作用下降,抑制自噬過度激活。

綜上,電針可改善失神經骨骼肌萎縮程度,下調自噬相關因子 Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達,自噬可能為電針延緩失神經骨骼肌萎縮進程機制之一。