香煙煙霧誘導小鼠氣道炎癥中的差異甲基化基因篩選及功能分析*

李萍 陳磊 楊梅 彭俊杰 文富強

(四川大學華西醫院呼吸與危重癥醫學科，四川 成都 610041)

慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種以持續呼吸道癥狀和氣流受限為特征的慢性疾病[1-2]。目前認為，吸煙是慢阻肺最主要的危險因素之一，香煙煙霧誘導的氣道炎癥反應是慢阻肺的主要病理基礎[1,3-4]，但其分子機制仍有待闡明。表觀遺傳指在不改變DNA序列的情況下，使遺傳表型發生變化。表觀遺傳修飾是基因調控的重要機制[5]。近年來研究表明，DNA甲基化，作為一種常見的表觀遺傳修飾，與慢阻肺易感性、急性加重及預后密切相關[6]，且香煙煙霧可直接導致氣道DNA甲基化的改變[7]，說明DNA甲基化可能介導機體對(內)外環境的刺激，進而參與慢阻肺的炎癥反應過程[8-9]，但目前關于DNA甲基化在香煙誘導的氣道炎癥中的變化和作用機制尚不完全清楚。本研究擬通過構建香煙煙霧誘導的氣道炎癥小鼠模型，利用全基因組甲基化捕獲測序技術，篩選其炎癥反應過程中的差異甲基化基因，并初步分析基因功能，為深入探討甲基化修飾在慢阻肺中的調控作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 SPF級C57BL/6系雄性小鼠(7～9周齡，體重20～22 g)購自四川大學實驗動物中心?？侱NA提取試劑盒購自Qiagen公司，甲基化試劑盒購自Agilent公司。

1.2 模型構建與取材 參照文獻[10]將20只小鼠隨機分為對照組(WT)與熏煙組(CS)，每組10只，分別暴露于過濾空氣和香煙煙霧，每次2 h，每天兩次，每周6 d，連續4 w。所有小鼠在暴露4 w后的第1天被放血處死，取小鼠右肺組織，4%多聚甲醛(pH 7.4)固定，常規石蠟包埋；左肺組織裝入液氮預冷的離心管內，轉移至液氮凍存。

1.3 蘇木精-伊紅(HE)染色 石蠟包塊切片(4 mm厚)，HE染色，于光學顯微鏡下觀察小鼠氣道的形態學變化和炎癥反應程度。

1.4 DNA提取 每組隨機選取3只小鼠的液氮凍存肺組織，按照DNA提取試劑盒說明書提取肺組織總DNA，確定A260/280比值在1.8～2.0之間的DNA樣本進行甲基化測序。

1.5 全基因組甲基化捕獲測序 基于Agilent SureSelectXT甲基化測序 (Methyl-Seq)靶向捕獲序列，對捕獲的DNA片段使用Illumina Novaseq PE150進行測序。原始數據經Fastp軟件(1.2.1版)、Bismark軟件 (0.19.0版)識別DMR，DMR是指基因組中甲基化修飾水平具有顯著差異的基因組區域，在對基因表達調控具有關鍵作用。使用methylKit軟件(1.6.1版)計算差值甲基化的P值。DMR定義為調整后P<0.05，甲基化率差異大于5%。并對DMR進行區域、基因注釋，獲得差異甲基化基因(DMG)。

1.6 生物信息分析 使用ClusterProfiler算法，將包含啟動子甲基化改變的DMG進行Gene Ontology(GO)功能分析，同時根據京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)進行通路富集分析，得到具有統計學意義(P<0.05)的生物學過程和信號轉導通路。

2 結果

2.1 香煙煙霧誘導小鼠氣道炎癥 HE染色結果顯示，與對照組相比，熏煙組的小鼠支氣管上皮細胞增生、支氣管周圍炎癥細胞浸潤，見圖1。

圖1 香煙煙霧誘導小鼠氣道炎癥(400×)

2.2 甲基化捕獲測序結果 熱圖(Heatmap)顯示，熏煙組與對照組的全基因組DNA甲基化譜呈現顯著不同(圖2)。數據分析顯示，篩選出DMR 2569個，其中低甲基化 1309個，高甲基化1260 個。通過基因注釋，獲得DMG 2002個，其中包含啟動子甲基化改變的DMG共565個。按照統計學顯著性排序，分別列出包含啟動子高甲基化(前10位)和低甲基化(前10位)的DMG，見表1。

2.3 GO和KEGG富集分析 GO分析發現DMG相關的生物學過程主要富集于細胞分化、細胞生長、代謝過程等。KEGG分析發現DMG相關的信號通路主要富集于Wnt、Hippo、Rap1等信號通路，見圖3。

3 討論

吸煙是慢阻肺的最主要危險因素之一。本研究的結果顯示香煙煙霧誘導小鼠氣道炎癥的同時，改變了目標基因群的甲基化狀態，后者參與了多個生物學過程和信號調控。

最近的研究證實慢阻肺伴隨廣泛的代謝失調，包括脂質代謝、糖脂代謝及谷氨酰胺代謝等[11-13]。進一步研究發現，香煙煙霧誘導的小鼠肺氣腫模型中存在脂質代謝[13]，同時香煙煙霧暴露可使人肺上皮細胞糖酵解減少，脂肪酸氧化增加[14]。本研究顯示多數DMG與代謝過程存在關聯，例如與代謝相關的Fth1、Mid1、Cd59a、Oas3等甲基化調控均可能參與其中。此外，DMG亦富集于細胞分化、細胞生長過程。氣道纖毛上皮細胞的分化和生長障礙在慢阻肺的發生發展具有關鍵作用[15]，其機制也可能與異常甲基化調控有關。

圖2 對照組(WT)與熏煙組(CS)差異甲基化基因(DMGs)熱圖

表1 位于啟動子的差異甲基化基因(DMGs)列表

圖3 GO(A)和KEGG(B)分析結果圖

目前認為免疫系統過度激活是慢阻肺氣道炎癥的特征之一[16]。其中，Wnt信號通路在免疫調節過程中常發揮重要作用[17-19]。肺組織表達多種Wnt配/受體及Wnt信號通路成分，香煙煙霧等損傷因素可激活Wnt通路[20-21]，后者進一步參與慢阻肺的炎癥-免疫、氧化應激、細胞增殖/凋亡等過程[3,20]。雖然目前缺乏Hippo信號通路在慢阻肺的研究，但已有研究證實Hippo信號通路與Wnt信號通路存在密切關聯[19]。本研究發現DMG富集于Wnt和Hippo信號通路，提示甲基化調控可能參與Wnt-Hippo信號的轉導過程。此外，Rap1可調節MAPK的活性，后者作為慢阻肺的“經典信號分子[20-23]，促進炎癥因子的釋放，進而參與慢阻肺的炎癥過程[24]，其調控機制仍然可能與目標基因異常甲基化相關。

4 結論

本研究表明，香煙煙霧誘導氣道炎癥的過程中，伴隨目標基因群的甲基化改變，后者進一步參與調控多個與“炎癥”有關的生物學過程和信號通路。基于此，甲基化修飾可能在(吸煙有關的)慢阻肺氣道炎癥中發揮重要作用，但其機制仍有待進一步研究。