白果內酯對膿毒癥急性肺損傷大鼠TLR4/NFκB信號通路及Th1/Th2細胞的影響*

趙俊泉 暴玉振 韓承河

(1.濟南市人民醫院急診科，山東 濟南 271100;2.山東第一醫科大學第二附屬醫院重癥監護室，山東 泰安 271000)

膿毒癥是以感染為主要病因的炎癥反應綜合征，可誘發多器官功能障礙綜合征[1-3]。其中急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)最早出現，且會使病情加重，導致患者呼吸衰竭而死亡[4-5]。ALI發生發展過程中，Toll樣受體-4(Toll like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路被激活，可使炎癥介質大量釋放，進而加重肺損傷[6]。輔助性T淋巴細胞1/2(Helper T lymphocyte 1/2，Th1/Th2)可反應機體內促炎、抗炎反應平衡情況[7]。白果內酯(Bilobalide，BB)是從銀杏果仁中提取的唯一一種倍半萜物質，具有抑制炎癥、減輕氧化應激水平等作用[8-9]。但白果內酯對膿毒癥所致ALI大鼠保護作用及對TLR4/NF-κB信號通路和Th1/Th2細胞的影響，還未見報導，本文探討白果內酯(BB)對膿毒癥致ALI大鼠Toll樣受體-4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)信號通路及輔助性T細胞1/2(Th1/Th2)的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級同遺傳背景的SD大鼠50 只，體重 200～220 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK(粵) 2018-0002，動物質量合格證號為省科委2000A027。所有大鼠于本院動物房中飼養，飼養條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對濕度50%，噪音低于80分貝，保持動物房環境及鼠籠清潔、透氣。本研究經北京動物倫理委員會批準同意，批號為IACUC-01(20160917)。

1.2 主要試劑及儀器 BB(貨號33570-04-6，南京春秋生物科技有限公司)；HE染色試劑盒(貨號E607218-0200，上海生工公司)；氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO) 、白細胞介素-6(Interleukin6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)等 ELISA試劑盒(貨號EK-0514，上海和序生物科技有限公司)；抗體TLR4、β-actin(貨號AP4016，AP1356美國Perkin Elmer公司)；蛋白提取試劑盒凝膠電泳遷移率轉變分析(EMSA)試劑盒(貨號：AP2032，美國pierce公司)；帶有NF-κB結合位點的寡核苷酸DNA3′-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCGG-5′,5′-AGTTGA GGGGACTTTCCCAGGC-3′；貨號：2018032402，上海生工生物技術有限公司；混合刺激劑(含離子霉素1 mg/L，莫能菌素3 mg/L，貨號：S3234，Sigma公司)；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒(貨號P0027、P0011，上海碧云天公司)等。手動輪轉式切片機(型號RM2125RTS，德國Leica公司)；光學顯微鏡(型號SMZ745，日本尼康公司)；酶標儀(型號XElx800，美國Perkin Elmer公司)；蛋白電泳儀、半干轉膜儀(型號1659001、Trans-Blot SD，美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(型號：GIS-500，MiuLab公司)等。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及分組給藥 參照文獻[10]采用盲腸結扎穿孔手術(CLP)制備大鼠膿毒癥ALI模型，操作方法：取45只SD大鼠以30 mg/kg劑量的2.5%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，仰臥固定于操作臺，清理腹部皮毛后，沿中線剪切3 vcm切口，打開腹腔，顯露盲腸，用1～0絲線在距盲腸端1 cm處結扎，用針穿刺盲腸形成漏點，隨后將盲腸放回腹腔，逐層縫合切口并包扎，術后觀察1～6 h內大鼠飲食、呼吸狀況，大鼠飲食減少，呼吸急促，眼、鼻處分泌物增多，并隨機取2只，取肺組織行染色，若肺組織出現肺間質水腫及炎性浸潤，表明造模成功，共造模成功40只大鼠(3只死亡)。結束后隨機分為ALI組、BB低劑量組(2.5 mg/kg)、BB高劑量組(10 mg/kg)、地塞米松陽性對照組(0.45 mg/kg)，每組各10只，另取10只大鼠僅暴露盲腸后關腹，設為Sham組。各組大鼠CLP術后6h開始給藥，BB低、高劑量藥物及地塞米松陽性藥物參照文獻[11-12]分別以生理鹽水配置為0.250、0.100、0.045 mg/mL的混懸液，藥物處理組大鼠均以10 mL/kg的劑量經尾靜脈注射3 d，每天3次，Sham組與ALI組均經尾靜脈注射等劑量生理鹽水。

1.3.2 肺組織采集 末次給藥結束后1 h，將大鼠麻醉處死，然后解剖大鼠，剪開大鼠腹部皮膚，暴露雙側肋膈角，在膈肌上剪一小口，使雙肺萎陷后，剪斷胸腔雙側肋骨及胸骨上緣，取出雙側肺組織，左側肺組織放入4%多聚甲醛中固定后，置于4 ℃冰箱中保存48 h以備HE 染色，右肺迅速置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.3 HE法檢測大鼠肺組織病理損傷 取出1.2.2中左肺，進行常規透明、浸蠟、包埋后、切成厚度為5 μm的切片后，用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蘇木精-伊紅染色5 min，1%鹽酸酒精分化10 s，蒸餾水漂洗2 min, 梯度酒精脫水2 min，二甲苯透明處理，中性光學樹脂封片后，置于顯微鏡下觀察肺組織形態。

1.3.4 ELISA法檢測大鼠肺組織MPO、IL-6、TNF-α含量 取1.2.2中右肺組織置于4℃冰箱中解凍后，剪碎，制備組織勻漿液，以ELISA試劑盒檢測其中MPO、IL-6、TNF-α水平，具體操作說明書進行。

1.3.5 EMSA法檢測大鼠肺組織NF-κB活性 取1.2.2中右肺組織，于4 ℃冰箱中解凍后，嚴格按核蛋白抽提試劑盒說明書方法提取肺組織核蛋白；制備生物素標記探針，用5′端生物素標記帶有 NF-κB 結合位點的寡核苷酸并將其作為探針，將核蛋白與探針在室溫下孵育20 min，然后以 6.5%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。用凝膠圖像分析系統進行分析。

1.3.6 Western blot法檢測大鼠肺組織TLR4通路蛋白表達 取1.2.2中右肺組織，置于4 ℃冰箱中解凍后，用蛋白裂解液提取蛋白，參照BCA試劑盒的說明書測定其中蛋白濃度，然后調整蛋白濃度至相同，經煮沸變性后，各取20 μL樣品液進行電泳分離蛋白，將全部蛋白轉移至PVDF膜上，置于5%的脫脂奶粉溶液中，于搖床上室溫封閉2 h。將目的蛋白條帶根據分子量截取下來，置于孵育盒中，加入1∶2000的兔源TLR4、β-actin一抗，于4 ℃冰箱中孵育過夜，經TBST漂洗3次，加入1∶1000的羊抗兔二抗溶液，于搖床上室溫孵育2 h，經TBST再次漂洗3次，采用增強化學發光法顯色。以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達。

1.3.7 FACS法檢測大鼠肺組織Th1/Th2細胞比值 取1.2.2中右肺組織，4 ℃冰箱中解凍后，剪碎，用胰蛋白酶處理消化，制備肺細胞懸液，取6×106個肺細胞與混合刺激劑混合后，在溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的條件下孵育24 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、離心后，分別取2×106個細胞加到標記為對照、α-干擾素(IFN-α)、IL-4的試管中后，再分別依次加入PerCP-CD 85 μL、異硫氰酸熒光素(FITC-CD)32 μL，在室溫避光條件下孵育30 min，洗滌、離心后，加溶血劑1 mL離心、棄上清，再分別加入750 μL 4%多聚甲醛和750 μL含10%正常鼠血清的0.1%皂素750 μL，室溫避光離心，棄上清后，向對照管中入5 μL熒光抗體同亞型抗體；向IFN-α管中加入20 μL IFN-α；向IL-4管中加入5μL IL-4。分別室溫避光30 min，0.1%皂素洗滌、離心后，棄上清，用500 μL PBS洗滌后，上機檢測。以SSC/CD3做點圖，取CD3陽性的細胞群做門(Rl)，取RI內的細胞以CDS/IFN-α和CDS/IL-4做點圖，讀取CDS/IFN-α細胞群百分數為Th1細胞的百分數，讀取CDS/IL-4細胞群百分數為Th2細胞的百分數，兩者比值即為Th1/Th2。

2 結果

2.1 白果內酯對大鼠肺組織病理損傷的影響 Sham組大鼠肺組織結構未見明顯損傷；ALI組大鼠可見肺間質水腫，大量炎癥細胞浸潤明顯，肺泡明顯減少等病理損傷；與ALI組比較，BB低、高劑量組及地塞米松陽性組肺間質水腫，炎癥細胞浸潤等病理損傷明顯減輕；與BB低劑量組比較，BB高劑量組及地塞米松陽性組肺組織水腫及病理損傷進一步減輕，見圖1。

2.2 BB對大鼠肺組織MPO、IL-6、TNF-α含量的影響 與Sham組相比，ALI組大鼠肺組織MPO、TNF-α、IL-6水平均明顯升高(P<0.05)；與ALI組相比，BB低、高劑量組及地塞米松陽性組大鼠肺組織MPO、TNF-α、IL-6水平均降低明顯(P<0.05)；與BB低劑量組相比，BB高劑量組及地塞米松陽性組大鼠肺組織MPO、TNF-α、IL-6水平均降低明顯(P<0.05)，見表1。

2.3 BB對大鼠肺組織TLR4蛋白表達及NF-κB活性的影響 與Sham組相比，ALI組大鼠肺組織TLR4蛋白表達、NF-κB活性均明顯升高(P<0.05)；與ALI組相比，BB低、高劑量組及地塞米松陽性組大鼠肺組織TLR4蛋白表達、NF-κB活性水平均明顯降低(P<0.05)；與BB低劑量組相比，BB高劑量組及地塞米松陽性組大鼠肺組織TLR4蛋白表達、NF-κB活性水平均明顯降低(P<0.05)，見圖2、表2。

圖1 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理損傷狀態(100×)

表1 各組大鼠肺組織MPO、TNF-α、IL-6水平

圖2 大鼠肺組織TLR4蛋白表達免疫印跡圖

表2 各組大鼠肺組織TLR4蛋白表達、NF-κB蛋白活性比較

2.4 BB對大鼠肺組織Th1/Th2平衡的影響 與Sham組相比，ALI組大鼠Th1/Th2、TNF-α/IL-6均明顯降低(P<0.05)；與ALI組相比，BB低、高劑量組及地塞米松陽性組大鼠肺組織Th1/Th2、TNF-α/IL-6均明顯升高(P<0.05)；與BB低劑量組相比，BB高劑量組及地塞米松陽性組大鼠肺組織Th1/Th2、TNF-α/IL-6均明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠肺組織Th1/Th2、TNF-α/IL-6水平比較

3 討論

膿毒癥引起的ALI發病率、死亡率較高，嚴重影響人類生命健康[13]。機體促炎反應和抗炎反應失衡是膿毒癥ALI機體炎癥反應失控的主要表現，T輔助淋巴細胞Th1/Th2能反映機體促炎和抗炎反應失衡情況[14]。Th1細胞主要分泌TNF-α、IL-2等促炎因子，而Th2細胞主要分泌IL-6、IL-10等抗炎因子，機體正常時，Th1/Th2處于動態平衡，維持機體正常細胞和體液免疫，膿毒癥感染過程中，早期以Th1反應為主，晚期以Th2反應為主，促炎和抗炎介質增多，預示病情嚴重及預后不良[15]。本研究采用盲腸結扎穿刺手術建立膿毒癥ALI模型，發現與Sham組相比，ALI模型組大鼠肺組織出現水腫、出血、炎性損傷等病理損傷現象，且肺組織TNF-α、IL-6含量明顯增高，且TNF-α/IL-6、Th1/Th2明顯降低，提示ALI模型組大鼠體內Th1/Th2平衡失調，促炎和抗炎反應紊亂，肺組織出現炎癥損傷，表明膿毒癥ALI模型造模成功。

目前，臨床上治療膿毒癥ALI無明顯特效藥物，而使用抗炎藥物抑制TNF-α、IL-10等促炎和抗炎介質釋放，使Th1/Th2趨于平衡，可緩解肺組織損傷[14-16]。BB為銀杏種子的主要活性物質，對心絞痛、冠心病、高血壓等心腦血管疾病有較好療效。近年有學者發現，BB可治療卡氏肺孢子蟲肺炎[8-9]。另外董志超[17]也發現，BB可通過抑制TLR4/NF-κB通路激活，降低炎癥反應，緩解肝炎模型大鼠肝纖維化程度。基于BB抗炎及對肺炎的保護作用，本研究推測BB可能對膿毒癥ALI有一定的改善作用，并建立膿毒癥ALI模型，對此進行驗證，發現與ALI組相比，BB低、高劑量及陽性對照組大鼠肺組織水腫、出血、炎性損傷等病理損傷明顯均減輕，TNF-α、IL-6含量降低、TNF-α/IL-6、Th1/Th2明顯升高，且BB高劑量組優于低劑量組，表明BB可能通過抑制TNF-α、IL-10等炎性相關因子釋放，調節Th1/Th2使其趨于正常，減輕膿毒癥ALI大鼠肺組織中炎應損傷。

MPO是存在于中性粒細胞和單核細胞中的一種代謝酶，其活性水平變化可反映單核細胞和中性粒細胞的活性和功能狀態，反映肺組織的損傷程度[18-19]。膿毒癥早期，炎癥介質和內毒素會刺激激單核和巨噬細胞活化，使TLR4受體激活，并進一步調節NF-κB表達，從而使IL-6和TNF-α等炎性介質大量釋放，導致毛細血管上皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，造成肺組織結構及功能損壞[20]。本研究發現，與Sham組比較，ALI模型組大鼠肺組織MPO活性、IL-6、TNF-α炎性因子含量、TLR4蛋白表達量及NF-κB活性均明顯升高，提示膿毒癥ALI大鼠肺組織損傷，可能與中性粒細胞及巨噬細胞活化，TLR4/NF-κB激活，IL-6、TNF-α等炎性因子水平增高有關。而給予BB低、高劑量及地塞米松治療后，大鼠肺組織MPO活性、IL-6、TNF-α炎含量、TLR4表達量及NF-κB活性均顯著低于ALI模型組，且BB高劑量組明顯低于BB低劑量組，表明BB可能通過抑制TLR4/NF-κB通路，抑制炎性介質釋放，降低炎性反應，改善膿毒癥誘導的ALI肺組織損傷。

4 結論與啟示

白果內酯可能通過抑制TLR4/NF-κB通路，調節Th1/Th2平衡，減少炎性介質釋放，改善膿毒癥ALI大鼠肺組織損傷，可能為膿毒癥ALI的臨床治療提供新思路。但本文未設置上調及抑制該信號通路進行對照驗證，存在一定不足，有待后續深入研究。