NrF2/Keap1/ARE信號通路在老年性青光眼患者小梁網組織功能損傷中的作用

王曉莉 張鍵 王友 李艷 龔雪 唐靜

(1簡陽市人民醫院眼科，四川 簡陽 641400；2四川大學華西醫院眼科)

老年性青光眼是一種視功能障礙性疾病，以眼壓升高所致的視乳頭低灌注為主要病理特征，臨床表現為視功能受損、視神經受壓等癥狀，小梁組織變異在其中發揮重要作用〔1〕。房水主要經小梁網流出，但小梁組織功能異常時會阻礙房水正常流出，使眼壓升高〔2〕。近年來研究顯示，氧化應激和線粒體功能受損是小梁網細胞功能異常的主要原因之一，但具體分子機制仍未闡明〔3〕。E2 相關因子(NrF)2是調節細胞內多種抗氧化物質活性水平的主要因子，能夠維持細胞的氧化-抗氧化平衡〔4〕。NrF2/ Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白(Keap)1/抗氧化反應元件(ARE)作為抗氧化應激信號通路已得到廣泛認可，與多種眼科疾病的發生與發展密切相關〔5〕。本研究旨在探討NrF2/Keap1/ARE信號通路在老年性青光眼患者小梁網組織功能損傷中的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2018年5月至2019年10月在簡陽市人民醫院確診為老年性青光眼患者42例(42眼)為老年性青光眼組。入選標準：①符合中國原發性青光眼診治專家共識中對老年性青光眼的相關診斷標準；②視力、色覺等視功能障礙，簽署知情同意書。排除標準：①虹膜炎、睫狀體炎等眼病所致的眼壓升高；②有眼部手術史或臨床資料不完整者。其中男24例，女18例；年齡62～81歲，平均(71.53±5.28)歲。另以因故死亡成人的供體眼球標本35例為對照組。其中男21例，女14例；年齡57～76歲，平均(69.95±4.75)歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2標本與主要試劑 老年性青光眼患者均行小梁切除術，將術中切除的小梁網組織標本分為兩部分，一分部液氮處理后-80℃保存；另一部分使用多聚甲醛固定后4℃冷藏保存。對照組切取小梁組織，標本處理方法同老年性青光眼組。免疫組化檢測試劑盒、Trizol試劑盒、RT-PCR試劑盒購于廣州國奧生物有限公司；全蛋白提取試劑盒購于上海百研生物有限公司；兔抗人NrF2、ARE多克隆抗體、鼠抗人Keap1單克隆抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG均購于江蘇恩莫阿賽生物有限公司；過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒均購于山東蘇柯漢生物工程有限公司。

1.3免疫組化染色 取多聚甲醛固定的小梁網組織，石蠟包埋后連續切片，厚度4 μm，加入二甲苯和乙醇溶液，脫蠟至水，修復液中高壓修復抗原，室溫冷卻后磷酸鹽緩沖液沖洗。3%H2O2孵育15 min，分別加入一抗(1∶500稀釋)，37℃孵育2 h，磷酸鹽緩沖液沖洗，加入二抗，室溫孵育20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染。梯度乙醇溶液逐級脫水，透明，中性樹脂封片。以磷酸鹽緩沖液代替一抗為陰性對照，陽性染色呈棕黃色，光學顯微鏡下計數NrF2、Keap1、ARE陽性表達率。

1.4RT-PCR檢測 取-80℃保存的小梁網組織標本，Trizol法提取總RNA，測定純度和濃度，逆轉錄得到cDNA。NrF2、Keap1、ARE及內參GAPDH引物由上海百研生物有限公司設計合成，NrF2引物序列：上游5'-GGGATATCACTCAGCATAAT-3'，下游5'-GGCGACTCGTTATTGATCGT-3'；Keap1引物序列：上游5'-CAATACTACAGCGTCGAAAATCT-3'，下游5'-GAGGTGGCATGTGCGGATGCTAT-3'；ARE引物序列：上游5'-TGACTAGTATTAGTCGGTAT-3'，下游5'-GTAGAGGTGAGTCGTCCGACC-3'；內參GAPDH引物序列：上游5'-GCAATGCGATTGATCCCGTAC-3'，下游5'-CAGCACTGACCCTTTGGTACT-3'。反應條件：94℃ 3 min，94℃ 50 s，50～65℃ 40 s，共35個循環，延伸72℃ 5 min。擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計算NrF2、Keap1、ARE mRNA的相對表達量。

1.5Western印跡檢測 取-80℃保存的小梁網組織標本，全蛋白提取試劑盒提取標本組織總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。取目標蛋白加入適量緩沖液，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后分別滴加兔抗人NrF2多克隆抗體(1∶500)、ARE多克隆抗體(1∶300)，鼠抗人Keap1單克隆抗體(1∶500)、GAPDH多克隆抗體(1∶1 000)，4℃冷藏過夜，次日滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG，山羊抗鼠IgG，均為1∶2 000稀釋，室溫孵育2 h，電化學(ECL)顯色，暗室中顯影、采集圖像，分析各條帶灰度值。

1.6小梁網組織中過氧化物酶和超氧化物歧化酶水平檢測 取-80℃保存的小梁網組織標本，組織勻漿，4℃ 12 000 r/min恒溫離心10 min，收集上清液，比色法檢測過氧化物酶和超氧化物歧化酶水平，檢測過程嚴格按試劑盒說明書進行。

1.7統計學分析 使用SPSS22.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗及Pearson相關分析。

2 結 果

2.1免疫組化檢測小梁網組織中NrF2、Keap1、ARE表達情況 免疫組化染色顯示，Keap1在老年性青光眼患者小梁網組織中存在大量陽性表達，而NrF2、ARE陽性表達不明顯。NrF2主要表達于細胞質，Keap1、ARE主要表達于細胞質和細胞核。老年性青光眼組NrF2、ARE陽性表達率顯著低于對照組，Keap1陽性率顯著高于對照組，差異有統計學意義(均P<0.01)。見圖1，表1。

圖1 免疫組化檢兩組測兩組小梁網組織中NrF2、Keap1、ARE表達(SP法，×200)

表1 兩組小梁網組織中NrF2、Keap1、ARE陽性表達率比較

2.2兩組小梁網組織中NrF2、Keap1、ARE mRNA和蛋白表達比較 老年性青光眼組小梁網組織中NrF2、ARE mRNA表達顯著低于對照組，Keap1 mRNA表達顯著高于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)；老年性青光眼組小梁網組織中NrF2、ARE蛋白表達顯著低于對照組，Keap1蛋白表達顯著高于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.01)。見表2，圖2。

表2 兩組NrF2、Keap1、ARE mRNA和蛋白相對表達量比較

圖2 小梁網組織中NrF2、Keap1、ARE蛋白Western印跡電泳

2.3兩組小梁網組織中過氧化物酶和超氧化物歧化酶水平比較 老年性青光眼組小梁網組織中過氧化物酶水平顯著高于對照組，超氧化物歧化酶水平顯著低于對照組，差異均有統計學意義(均P<0.01)。見表3。

表3 兩組小梁網組織中過氧化物酶和超氧化物歧化酶水平比較

2.4老年性青光眼組小梁網組織中NrF2、Keap1、ARE表達與過氧化物酶和超氧化物歧化酶的相關性 NrF2、ARE與過氧化物酶水平呈負相關(r=-0.718、-0.763，P=0.003、0.000)，與超氧化物歧化酶水平呈正相關(r=0.750、0.795，均P=0.000)。Keap1與過氧化物酶水平呈正相關(r=0.811，P=0.000)，與超氧化物歧化酶水平呈負相關(r=-0.849，P=0.000)。

3 討 論

老年性青光眼以視野障礙和視盤受損為主要特征。相關研究顯示，眼壓≥20 mmHg患者老年性青光眼的發生風險約為眼壓<20 mmHg患者的16倍，提示高眼壓是老年性青光眼的主要病理因素〔6〕。小梁網位于前房角的角鞏膜邊緣區域，呈三角形，能夠調節房水流出〔7〕；研究者在小梁網胞外基質中觀察到了大量基因突變，硬度增加，提示小梁網內皮細胞增加、組織硬化等是老年性青光眼患者眼壓升高的主要原因，眼壓升高會進一步壓縮小梁網，造成細胞外基質沉積，房水流出阻力增加〔8〕。因此，探討小梁網組織病變的相關機制對提升老年性青光眼的降眼壓治療效果具有重要意義。

轉錄因子NrF2在亮氨酸調節蛋白家族成員中活性最強，廣泛表達于人體各器官和組織細胞中〔9〕。NrF2包括NeH1～6個不同的功能區域，其中NeH1為含C末端的結構域，參與NrF2識別并結合抗氧化活性因子ARE；NeH2與Keap1結合后能夠抑制NrF2活化，使NrF2處于失活狀態；NeH3是NrF2的轉錄激活區域，與重組蛋白結合后能夠上調NrF2靶基因的表達；NeH4和NeH5同時與輔助因子CBP結合后，能夠啟動NrF2下游基因轉錄；NeH6是氧化還原反應的不敏感區，能夠降解氧化激活的NrF2〔10，11〕。綜合上述各功能區域的作用，NrF2高表達能夠促進機體的抗氧化作用，降低機體的氧化應激反應。Keap1是NrF2的多區域抑制蛋白，由CTR、NTR、DGR在內的5個結構域組成〔12〕。Keap1能夠通過DGR區域與NrF2特異性結合，分布于肌動蛋白細胞骨架上，抑制NrF2進入細胞核，進而抑制其活性〔13〕。同時CTR、NTR能夠參與泛素連接酶的合成，參與NrF2降解，與NrF2穩定性有關〔14〕。因此，Keap1表達上調會降低NrF2活性和穩定性，增強體內的氧化應激反應。抗氧化反應元件ARE是人體重要的保護性應答元件，序列位于編碼保護蛋白基因上游的啟動子區，激活后可上調NADH氧化還原酶復合物、谷胱甘肽轉移酶等多種保護性基因的表達〔15〕。

本研究結果提示老年性青光眼患者小梁網組織中NrF2、ARE低表達，Keap1高表達。目前關于NrF2/Keap1/ARE信號通路激活機制的研究顯示，NrF2介導細胞防御的開啟和關閉主要與Keap1的負性調節有關〔16〕。人體正常狀態下，NrF2主要分布于細胞質，與抑制蛋白Keap1處于動態平衡狀態，維持機體的氧化應激平衡〔17〕。當受到抗氧化劑或親電子物質作用時，Keap1上的氨基酸殘基被修飾，構象發生改變，與NrF2的耦聯作用減弱，NrF2活性增強，Keap1與NrF2之間的平衡狀態被打破，機體氧化應激狀態減弱〔18〕。同時NrF2還存在另一種磷酸化激活方式，當NrF2被磷酸化激活后會出現核內轉位，通過植物堿性亮氨酸拉鏈結構與小Maf家族蛋白特異性結合形成活化ARE，減弱機體的氧化應激狀態〔19〕。

線粒體分泌的活性氧是人體氧化應激的主要促進因素，促氧化標志物過氧化物酶和抗氧化標志物超氧化物歧化酶可從多個途徑損傷小梁網細胞DNA，導致小梁網細胞死亡〔20〕。本研究結果提示NrF2、ARE高表達能夠有效降低老年性青光眼患者小梁網組織中的促氧化活性物質分泌水平，提升抗氧化活性物質的分泌水平，抑制氧化應激狀態，進而降低眼壓，實現控制和改善臨床癥狀的目的。

綜上，老年性青光眼患者小梁網組織中NrF2、ARE低表達，Keap1高表達，與氧化應激狀態有關。通過激活NrF2/Keap1/ARE信號通路可能改善小梁網組織線粒體功能，抑制氧化應激狀態，降低眼內壓，控制患者的臨床癥狀。