尼古丁加重慢性他克莫司腎毒性的機制

張競月 金海峰 李燦 金華

(延邊大學附屬醫院腎病科,吉林 延吉 133000)

他克莫司(TAC)作為一種非常有效的免疫抑制劑，已被廣泛應用于器官移植、自身免疫性疾病、結締組織病、難治性腎病綜合征的治療，盡管發現了不少新的免疫抑制劑，TAC仍是實體器官移植免疫抑制方案的基石。然而，長期使用TAC會增加不良反應的風險(如腎毒性、神經毒性、感染、惡性腫瘤、糖尿病和胃腸道不適)。眾所周知，吸煙是導致各種癌癥、心血管事件(心肌梗死和腦卒中)和阻塞性肺病的危險因素。吸煙是一項重大的公共衛生挑戰，給社會帶來經濟負擔，降低生活質量。在腎臟方面，吸煙會加重糖尿病、高血壓、多囊腎和腎移植術后患者的腎功能不全程度〔1〕。吸煙還可能導致腎損傷，即使是不存在慢性腎臟病(CKD)的健康人群〔2〕。尼古丁(NIC) 作為煙草中的天然成分，有成癮性及毒性作用，是對人體產生有害影響的罪魁禍首之一。吸煙是腎臟疾病的一個重要且可控制的危險因素，本研究通過NIC處理TAC誘導的腎損傷大鼠模型，探討NIC加速其腎毒性的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 將32只體重為200～220 g的清潔級雄性SD大鼠(延邊大學動物實驗中心購買) ，分別置于恒定溫度、濕度、光照控制的環境中，并允許自由攝入低鹽飲食(0.05%鹽飼料，低鹽飲食增強TAC腎毒性) 和自來水。適應環境、低鹽飲食和自由飲水后，體重匹配的大鼠隨機分為4組，每組8只。①正常對照組(VH組)：皮下注射橄欖油1 ml/(kg·d)。②NIC組：皮下注射橄欖油1 ml/(kg·d)+腹腔注射NIC 1.5 mg/(kg·d)。③TAC組：皮下注射TAC 1.5 mg/(kg·d)。④TAC+NIC組：皮下注射TAC 1.5 mg/(kg·d)+ 腹腔注射NIC 1.5 mg/(kg·d)。各組均每日9∶00給藥，共處理4 w后處死大鼠，收集血液、尿液、腎組織標本以備進一步檢測。本實驗通過延邊大學附屬醫院倫理委員會批準(YBU-2017-045)。

1.2生化檢測 全自動生化分析儀測定血白細胞計數(ADVIA 120 ，日本拜耳公司)；標準酶比色法測定血肌酐(Scr) 及血尿素氮(BUN)(Stanbio Lahoratory,Boeme,TX,USA);May-Grun-wald Giemsa 染色法計數淋巴細胞數，使用高效液相-串聯質譜法測定TAC血藥濃度(TAC con)；尿蛋白排泄量測定采用酶學比色法(Modular DPP system,Roche)。使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清和尿排泄中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)；采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Calbiotech,San Diego,CA) 測定大鼠血清和尿中的可替寧。

1.3腎臟病理 腎臟組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液(PLP) 固定，過碘酸雪夫(PAS)染色，石蠟包埋后4 μm切片，Masson 三色染色，采用彩色圖像自動分析儀(Olympus,日本)高倍鏡視野下分析腎小管間質纖維化(TIF)程度， 每個標本至少觀察 20 個非重疊腎小管間質取平均值。

1.4Western印跡法 腎組織標本置于管中，加入蛋白質緩沖液(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH7.6；150 mmol/ml氯化鈉，1%脫氧膽酸鈉，1%聚乙二醇辛基苯基醚，0.1%十二烷基硫酸鈉，1%抑酶肽，2 mmol/L四氧嘧啶，1 ng/ml亮抑酶肽，1 mmol/L苯甲基磺酰氟化物),室溫勻漿。然后在4℃下，13 000 r/min離心，取上清液，用Bio-Rad蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。取同等量的勻漿在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。在90 V電壓下轉到硝酸纖維素膜2 h。浸入5%脫脂奶粉中封閉2 h，在4℃下分別滴加一抗NADPH氧化酶(NOX)-2(1∶500)、NOX-4(1∶500)、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2(1∶500)、轉化生長因子(TGF)-β1(1∶500)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)(1∶500)、超氧化物歧化酶(SOD)1(1∶500)、 SOD2(1∶500)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3(1∶500)〕，一抗與5%脫脂奶粉混合，緩慢搖擺，4℃下過夜。TBST反復洗膜3次，加二抗4 h；TBST反復沖洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜3次，搖床沖洗10 min。使用電化學增強(ECL)試劑增強發光，在暗室下膠片曝光，后采集圖像。使用圖像分析儀(Quantity One) 進行Western印跡圖像分析。

1.5原位缺口末端標記(TUNEL) 根據 ApopTag in Situ Apoptosis Detection(Millipore)試劑盒操作步驟測定細胞凋亡，200高倍下數字化顯微鏡分析儀計數TUNEL 陽性細胞。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0 軟件進行單因素方差分析(Oneway ANOVA)和 Bonferroni post hoc 校正分析。

2 結 果

2.1NIC對基本數據及腎功能的影響 與VH組比較，TAC組尿量明顯增加，而NIC+TAC組尿量較TAC組進一步增加(P<0.05)；TAC組、NIC組尿蛋白、BUN、Scr水平均明顯升高(P<0.05)，而NIC+TAC組的尿蛋白、BUN、Scr水平較TAC組進一步升高(P<0.05)，提示NIC加重TAC誘導的腎功能不全。給藥4 w后，血中TAC濃度增加，而NIC則不影響血TAC濃度，見表1。

表1 各組基本參數及實驗室檢測結果

2.2NIC對TAC誘導的腎纖維化及腎小球硬化的影響 TAC組與NIC組腎組織TIF程度明顯增加，NIC+TAC組腎組織TIF程度較TAC組明顯增加，見圖1。Western印跡法結果顯示，與VH組〔(107.50±15.26)%〕相比，TAC組〔(192.90±17.14)%〕與NIC組〔(189.50±12.58)%〕腎組織中TGF-β1表達量明顯增加，NIC+TAC組〔(253.20±22.56)%〕腎組織中TGF-β1表達量較TAC組明顯增加(P<0.05)，提示NIC增強了TAC誘導的促纖維化TGF-β1過表達。見圖2。

圖1 各組腎組織TIF程度比較(Masson，×200)

圖2 Western印跡法檢測各組腎組織TGF-β1的表達

與VH組〔(1.34±0.58)%〕相比，TAC組與NIC組腎組織PAS染色系膜面積〔(16.23±1.99、14.48±1.56)%〕明顯增加， 而NIC+TAC組的腎組織中PAS染色系膜面積〔(22.24±2.17)%〕較TAC組明顯增加(均P<0.05)。見圖3。

圖3 各組腎組織病理形態學變化(PAS，×1 000)

2.3NIC對TAC誘導的氧化應激的影響 與VH組比較，TAC組與NIC組血清及尿排泄8-OhdG含量均明顯增多(均P<0.05)，NIC+TAC組血清及尿排泄8-OHdG含量較TAC組明顯增多(P<0.05)，見表2。

表2 各組血及尿中8-OHdG水平的比較

與VH組相比，TAC組與NIC組腎組織中SOD1、SOD2表達降低，NIC+TAC組腎組織中SOD1、SOD2的表達較TAC組明顯降低。見表3、圖4。TAC組與NIC組腎組織中NOX-2、NOX-4的表達升高，NIC+TAC組腎組織中NOX-2、NOX-4的表達較TAC組明顯升高。見表3、圖5。上述分析顯示，NIC上調了TAC誘導的NOX2和NOX4的表達，而抑制了SOD1和SOD2的表達，說明在本模型中NIC和TAC對氧化應激有協同作用。

表3 各組腎組織SOD1、SOD2、NOX-2、NOX-4、Bcl-2/Bax、Cleaved caspase-3的Western印跡表達量

圖4 各組腎組織中SOD1、SOD2表達

圖5 各組腎組織NOX-2、NOX-4表達

2.4NIC對TAC誘導的細胞凋亡的影響 大多數TUNEL陽性細胞或凋亡小體定位于腎小管上皮細胞和間質血管內皮細胞，尤其是萎縮的腎小管和典型的TIF區域。與VH組(0.8±0.1)mm2比較，TAC組與NIC組腎組織中TUNEL陽性細胞數量〔(9.6±0.8)、(3.8±0.2)〕mm2明顯增加，NIC + TAC組腎組織中TUNEL陽性細胞數量(13.9±0.4)mm2較TAC組明顯增加。見圖6。Western印跡結果示，與VH組比較，NIC組與TAC組腎組織中Bcl-2/Bax比值降低，NIC+TAC組腎組織中Bcl-2/Bax比值較TAC組明顯降低。TAC組與NIC組腎組織中活化的Caspase-3升高，NIC + TAC組腎組織中活化的Caspase-3較TAC組明顯升高。見表3、圖7。

圖6 各組腎小管TUNEL陽性細胞數(×200)

圖7 各組腎組織中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3的表達

3 討 論

無論是健康人群，還是有基礎疾病(如高血壓、糖尿病)的患者，吸煙是一個可控制的引起CKD進展的危險因素〔3〕。研究表明，NIC會增加腎臟的氧化應激，從而損害腎小管和內皮細胞的活力和功能，改變腎臟血流動力學，損害整體腎臟功能〔4〕。此外，NIC增強系膜增生、影響細胞增殖與凋亡、促進細胞外基質堆積和促進腎纖維化途徑來損害腎臟功能〔2,5,6〕。臨床試驗表明，吸煙可增加尿白蛋白排泄量，對腎功能產生不利影響，而戒煙可能改善蛋白尿和腎小球濾過率，同時也可能改善CKD和2型糖尿病患者的蛋白尿，并減緩終末期腎衰竭(ESRD)的進展〔7～9〕。此外，無論是移植物受體還是供體，吸煙都會導致移植排斥反應和慢性移植物腎病(CAN)，最終導致腎移植中的移植物丟失〔10,11〕。提示吸煙可能會加速接受基于TAC的免疫抑制劑的移植腎功能的喪失。

作為有效且具有良好耐受性的臨床免疫抑制劑，TAC的長期使用可導致腎小球系膜細胞和基質增多、小動脈透明質酸沉積、腎小管萎縮、腎小球硬化和腎臟間質纖維化，最終產生不可逆的腎臟損傷。本文說明NIC導致腎臟損傷，與先前研究一致〔12〕。然而腎毒性模型大鼠用NIC處理后腎功能損傷指標進一步升高，表明NIC加重TAC誘導的腎損傷。

慢性TAC腎毒性的主要改變在于腎小管間質區，如腎小管基底膜增厚、腎小管萎縮和腎小管纖維化。本研究發現，NIC加重了TAC誘導的部分系膜面積增加和TIF程度。這些病理改變引起更明顯的腎功能損害和尿蛋白排泄的增加。提示吸煙可能加快接受免疫抑制劑治療患者的腎功能損傷。戒煙可能成為延緩或治療腎臟纖維化的重要手段。

慢性TAC腎損傷是多種因素共同導致的結果，TAC腎損傷與氧化應激之間存在密切關系。氧化應激是因為氧化還原系統遭到破壞，從而產生大量的活性氧。最近大量研究表明，慢性NIC暴露與腎臟損傷的氧化應激之間存在密切關系〔13,14〕。氧化應激在TIF及腎小球系膜硬化、足細胞異常和頂葉上皮細胞損傷的腎小球硬化中起著至關重要的作用〔15〕。8-OHdG作為體內DNA氧化損傷分泌最終產物的標志物，一般蓄積在腎間質和腎小管中，且與機體氧化損傷程度呈正相關。SOD是體內重要的抗氧化劑，在維持機體氧化與抗氧化的平衡中起著至關重要的作用。它能阻斷自由基導致的脂質過氧化生成，保護其不受自由基的損害〔16〕。近年來多種不同的腎臟病理模型中發現NADPH氧化酶家族(NOXs) 促進腎臟氧化應激的發生。NOX-2和NOX-4是吞噬細胞中NADPH氧化酶的催化亞基。NOX-2的激活稱為氧化爆發，促進活性氧的生成，導致腎臟損傷。鄭茜子等〔17〕研究發現，抑制NADPH氧化酶系統可減輕大鼠腎間質纖維化。本研究說明NIC增加了氧化蛋白的表達，同時抑制了抗氧化蛋白的表達，從而加重了TAC誘導的氧化應激和腎臟纖維化。

細胞凋亡是程序性細胞死亡的一種獨特形式。該過程在發育和維持內環境的穩定中起著至關重要的作用。TAC誘導的腎損傷與近端腎小管細胞凋亡有關。NIC通過氧化應激或激活TGF-β1誘導足細胞和腎近端小管細胞凋亡〔18,19〕。Bcl-2是抑制凋亡基因。Bax是Bcl-2蛋白家族的一員，當Bax與線粒體外膜結合時會啟動細胞凋亡途徑，從而改變其通透性并釋放凋亡蛋白。凋亡Bax和抗凋亡Bcl-2蛋白之間的平衡失衡，在啟動凋亡途徑的過程中發揮至關重要的作用〔20〕。Caspase-3是凋亡細胞死亡的執行者，其激活被認為是細胞死亡的一種承諾〔21〕。細胞和組織中Caspase-3活性檢測是多種凋亡信號誘導的細胞凋亡的重要方法。上述研究表明，TAC和NIC均誘導細胞凋亡，而NIC能夠加重TAC誘導的細胞凋亡，從而進一步導致腎臟損傷。

綜上，NIC在TAC慢性腎毒性大鼠模型中加重了TAC誘導的腎損傷。氧化應激的加重和程序性細胞死亡可能是NIC有害作用的一個潛在機制。