尼古丁加重慢性他克莫司腎毒性的機制

張競月 金海峰 李燦 金華

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科,吉林 延吉 133000)

他克莫司(TAC)作為一種非常有效的免疫抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于器官移植、自身免疫性疾病、結(jié)締組織病、難治性腎病綜合征的治療，盡管發(fā)現(xiàn)了不少新的免疫抑制劑，TAC仍是實體器官移植免疫抑制方案的基石。然而，長期使用TAC會增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(如腎毒性、神經(jīng)毒性、感染、惡性腫瘤、糖尿病和胃腸道不適)。眾所周知，吸煙是導(dǎo)致各種癌癥、心血管事件(心肌梗死和腦卒中)和阻塞性肺病的危險因素。吸煙是一項重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，給社會帶來經(jīng)濟負擔，降低生活質(zhì)量。在腎臟方面，吸煙會加重糖尿病、高血壓、多囊腎和腎移植術(shù)后患者的腎功能不全程度〔1〕。吸煙還可能導(dǎo)致腎損傷，即使是不存在慢性腎臟病(CKD)的健康人群〔2〕。尼古丁(NIC) 作為煙草中的天然成分，有成癮性及毒性作用，是對人體產(chǎn)生有害影響的罪魁禍首之一。吸煙是腎臟疾病的一個重要且可控制的危險因素，本研究通過NIC處理TAC誘導(dǎo)的腎損傷大鼠模型，探討NIC加速其腎毒性的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 將32只體重為200～220 g的清潔級雄性SD大鼠(延邊大學(xué)動物實驗中心購買) ，分別置于恒定溫度、濕度、光照控制的環(huán)境中，并允許自由攝入低鹽飲食(0.05%鹽飼料，低鹽飲食增強TAC腎毒性) 和自來水。適應(yīng)環(huán)境、低鹽飲食和自由飲水后，體重匹配的大鼠隨機分為4組，每組8只。①正常對照組(VH組)：皮下注射橄欖油1 ml/(kg·d)。②NIC組：皮下注射橄欖油1 ml/(kg·d)+腹腔注射NIC 1.5 mg/(kg·d)。③TAC組：皮下注射TAC 1.5 mg/(kg·d)。④TAC+NIC組：皮下注射TAC 1.5 mg/(kg·d)+ 腹腔注射NIC 1.5 mg/(kg·d)。各組均每日9∶00給藥，共處理4 w后處死大鼠，收集血液、尿液、腎組織標本以備進一步檢測。本實驗通過延邊大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(YBU-2017-045)。

1.2生化檢測 全自動生化分析儀測定血白細胞計數(shù)(ADVIA 120 ，日本拜耳公司)；標準酶比色法測定血肌酐(Scr) 及血尿素氮(BUN)(Stanbio Lahoratory,Boeme,TX,USA);May-Grun-wald Giemsa 染色法計數(shù)淋巴細胞數(shù)，使用高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測定TAC血藥濃度(TAC con)；尿蛋白排泄量測定采用酶學(xué)比色法(Modular DPP system,Roche)。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清和尿排泄中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Calbiotech,San Diego,CA) 測定大鼠血清和尿中的可替寧。

1.3腎臟病理 腎臟組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液(PLP) 固定，過碘酸雪夫(PAS)染色，石蠟包埋后4 μm切片，Masson 三色染色，采用彩色圖像自動分析儀(Olympus,日本)高倍鏡視野下分析腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)程度， 每個標本至少觀察 20 個非重疊腎小管間質(zhì)取平均值。

1.4Western印跡法 腎組織標本置于管中，加入蛋白質(zhì)緩沖液(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH7.6；150 mmol/ml氯化鈉，1%脫氧膽酸鈉，1%聚乙二醇辛基苯基醚，0.1%十二烷基硫酸鈉，1%抑酶肽，2 mmol/L四氧嘧啶，1 ng/ml亮抑酶肽，1 mmol/L苯甲基磺酰氟化物),室溫勻漿。然后在4℃下，13 000 r/min離心，取上清液，用Bio-Rad蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。取同等量的勻漿在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。在90 V電壓下轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜2 h。浸入5%脫脂奶粉中封閉2 h，在4℃下分別滴加一抗NADPH氧化酶(NOX)-2(1∶500)、NOX-4(1∶500)、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2(1∶500)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1(1∶500)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)(1∶500)、超氧化物歧化酶(SOD)1(1∶500)、 SOD2(1∶500)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Cleaved caspase)-3(1∶500)〕，一抗與5%脫脂奶粉混合，緩慢搖擺，4℃下過夜。TBST反復(fù)洗膜3次，加二抗4 h；TBST反復(fù)沖洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜3次，搖床沖洗10 min。使用電化學(xué)增強(ECL)試劑增強發(fā)光，在暗室下膠片曝光，后采集圖像。使用圖像分析儀(Quantity One) 進行Western印跡圖像分析。

1.5原位缺口末端標記(TUNEL) 根據(jù) ApopTag in Situ Apoptosis Detection(Millipore)試劑盒操作步驟測定細胞凋亡，200高倍下數(shù)字化顯微鏡分析儀計數(shù)TUNEL 陽性細胞。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 軟件進行單因素方差分析(Oneway ANOVA)和 Bonferroni post hoc 校正分析。

2 結(jié) 果

2.1NIC對基本數(shù)據(jù)及腎功能的影響 與VH組比較，TAC組尿量明顯增加，而NIC+TAC組尿量較TAC組進一步增加(P<0.05)；TAC組、NIC組尿蛋白、BUN、Scr水平均明顯升高(P<0.05)，而NIC+TAC組的尿蛋白、BUN、Scr水平較TAC組進一步升高(P<0.05)，提示NIC加重TAC誘導(dǎo)的腎功能不全。給藥4 w后，血中TAC濃度增加，而NIC則不影響血TAC濃度，見表1。

表1 各組基本參數(shù)及實驗室檢測結(jié)果

2.2NIC對TAC誘導(dǎo)的腎纖維化及腎小球硬化的影響 TAC組與NIC組腎組織TIF程度明顯增加，NIC+TAC組腎組織TIF程度較TAC組明顯增加，見圖1。Western印跡法結(jié)果顯示，與VH組〔(107.50±15.26)%〕相比，TAC組〔(192.90±17.14)%〕與NIC組〔(189.50±12.58)%〕腎組織中TGF-β1表達量明顯增加，NIC+TAC組〔(253.20±22.56)%〕腎組織中TGF-β1表達量較TAC組明顯增加(P<0.05)，提示NIC增強了TAC誘導(dǎo)的促纖維化TGF-β1過表達。見圖2。

圖1 各組腎組織TIF程度比較(Masson，×200)

圖2 Western印跡法檢測各組腎組織TGF-β1的表達

與VH組〔(1.34±0.58)%〕相比，TAC組與NIC組腎組織PAS染色系膜面積〔(16.23±1.99、14.48±1.56)%〕明顯增加， 而NIC+TAC組的腎組織中PAS染色系膜面積〔(22.24±2.17)%〕較TAC組明顯增加(均P<0.05)。見圖3。

圖3 各組腎組織病理形態(tài)學(xué)變化(PAS，×1 000)

2.3NIC對TAC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響 與VH組比較，TAC組與NIC組血清及尿排泄8-OhdG含量均明顯增多(均P<0.05)，NIC+TAC組血清及尿排泄8-OHdG含量較TAC組明顯增多(P<0.05)，見表2。

表2 各組血及尿中8-OHdG水平的比較

與VH組相比，TAC組與NIC組腎組織中SOD1、SOD2表達降低，NIC+TAC組腎組織中SOD1、SOD2的表達較TAC組明顯降低。見表3、圖4。TAC組與NIC組腎組織中NOX-2、NOX-4的表達升高，NIC+TAC組腎組織中NOX-2、NOX-4的表達較TAC組明顯升高。見表3、圖5。上述分析顯示，NIC上調(diào)了TAC誘導(dǎo)的NOX2和NOX4的表達，而抑制了SOD1和SOD2的表達，說明在本模型中NIC和TAC對氧化應(yīng)激有協(xié)同作用。

表3 各組腎組織SOD1、SOD2、NOX-2、NOX-4、Bcl-2/Bax、Cleaved caspase-3的Western印跡表達量

圖4 各組腎組織中SOD1、SOD2表達

圖5 各組腎組織NOX-2、NOX-4表達

2.4NIC對TAC誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響 大多數(shù)TUNEL陽性細胞或凋亡小體定位于腎小管上皮細胞和間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞，尤其是萎縮的腎小管和典型的TIF區(qū)域。與VH組(0.8±0.1)mm2比較，TAC組與NIC組腎組織中TUNEL陽性細胞數(shù)量〔(9.6±0.8)、(3.8±0.2)〕mm2明顯增加，NIC + TAC組腎組織中TUNEL陽性細胞數(shù)量(13.9±0.4)mm2較TAC組明顯增加。見圖6。Western印跡結(jié)果示，與VH組比較，NIC組與TAC組腎組織中Bcl-2/Bax比值降低，NIC+TAC組腎組織中Bcl-2/Bax比值較TAC組明顯降低。TAC組與NIC組腎組織中活化的Caspase-3升高，NIC + TAC組腎組織中活化的Caspase-3較TAC組明顯升高。見表3、圖7。

圖6 各組腎小管TUNEL陽性細胞數(shù)(×200)

圖7 各組腎組織中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3的表達

3 討 論

無論是健康人群，還是有基礎(chǔ)疾病(如高血壓、糖尿病)的患者，吸煙是一個可控制的引起CKD進展的危險因素〔3〕。研究表明，NIC會增加腎臟的氧化應(yīng)激，從而損害腎小管和內(nèi)皮細胞的活力和功能，改變腎臟血流動力學(xué)，損害整體腎臟功能〔4〕。此外，NIC增強系膜增生、影響細胞增殖與凋亡、促進細胞外基質(zhì)堆積和促進腎纖維化途徑來損害腎臟功能〔2,5,6〕。臨床試驗表明，吸煙可增加尿白蛋白排泄量，對腎功能產(chǎn)生不利影響，而戒煙可能改善蛋白尿和腎小球濾過率，同時也可能改善CKD和2型糖尿病患者的蛋白尿，并減緩終末期腎衰竭(ESRD)的進展〔7～9〕。此外，無論是移植物受體還是供體，吸煙都會導(dǎo)致移植排斥反應(yīng)和慢性移植物腎病(CAN)，最終導(dǎo)致腎移植中的移植物丟失〔10,11〕。提示吸煙可能會加速接受基于TAC的免疫抑制劑的移植腎功能的喪失。

作為有效且具有良好耐受性的臨床免疫抑制劑，TAC的長期使用可導(dǎo)致腎小球系膜細胞和基質(zhì)增多、小動脈透明質(zhì)酸沉積、腎小管萎縮、腎小球硬化和腎臟間質(zhì)纖維化，最終產(chǎn)生不可逆的腎臟損傷。本文說明NIC導(dǎo)致腎臟損傷，與先前研究一致〔12〕。然而腎毒性模型大鼠用NIC處理后腎功能損傷指標進一步升高，表明NIC加重TAC誘導(dǎo)的腎損傷。

慢性TAC腎毒性的主要改變在于腎小管間質(zhì)區(qū)，如腎小管基底膜增厚、腎小管萎縮和腎小管纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，NIC加重了TAC誘導(dǎo)的部分系膜面積增加和TIF程度。這些病理改變引起更明顯的腎功能損害和尿蛋白排泄的增加。提示吸煙可能加快接受免疫抑制劑治療患者的腎功能損傷。戒煙可能成為延緩或治療腎臟纖維化的重要手段。

慢性TAC腎損傷是多種因素共同導(dǎo)致的結(jié)果，TAC腎損傷與氧化應(yīng)激之間存在密切關(guān)系。氧化應(yīng)激是因為氧化還原系統(tǒng)遭到破壞，從而產(chǎn)生大量的活性氧。最近大量研究表明，慢性NIC暴露與腎臟損傷的氧化應(yīng)激之間存在密切關(guān)系〔13,14〕。氧化應(yīng)激在TIF及腎小球系膜硬化、足細胞異常和頂葉上皮細胞損傷的腎小球硬化中起著至關(guān)重要的作用〔15〕。8-OHdG作為體內(nèi)DNA氧化損傷分泌最終產(chǎn)物的標志物，一般蓄積在腎間質(zhì)和腎小管中，且與機體氧化損傷程度呈正相關(guān)。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化劑，在維持機體氧化與抗氧化的平衡中起著至關(guān)重要的作用。它能阻斷自由基導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化生成，保護其不受自由基的損害〔16〕。近年來多種不同的腎臟病理模型中發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶家族(NOXs) 促進腎臟氧化應(yīng)激的發(fā)生。NOX-2和NOX-4是吞噬細胞中NADPH氧化酶的催化亞基。NOX-2的激活稱為氧化爆發(fā)，促進活性氧的生成，導(dǎo)致腎臟損傷。鄭茜子等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，抑制NADPH氧化酶系統(tǒng)可減輕大鼠腎間質(zhì)纖維化。本研究說明NIC增加了氧化蛋白的表達，同時抑制了抗氧化蛋白的表達，從而加重了TAC誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和腎臟纖維化。

細胞凋亡是程序性細胞死亡的一種獨特形式。該過程在發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用。TAC誘導(dǎo)的腎損傷與近端腎小管細胞凋亡有關(guān)。NIC通過氧化應(yīng)激或激活TGF-β1誘導(dǎo)足細胞和腎近端小管細胞凋亡〔18,19〕。Bcl-2是抑制凋亡基因。Bax是Bcl-2蛋白家族的一員，當Bax與線粒體外膜結(jié)合時會啟動細胞凋亡途徑，從而改變其通透性并釋放凋亡蛋白。凋亡Bax和抗凋亡Bcl-2蛋白之間的平衡失衡，在啟動凋亡途徑的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用〔20〕。Caspase-3是凋亡細胞死亡的執(zhí)行者，其激活被認為是細胞死亡的一種承諾〔21〕。細胞和組織中Caspase-3活性檢測是多種凋亡信號誘導(dǎo)的細胞凋亡的重要方法。上述研究表明，TAC和NIC均誘導(dǎo)細胞凋亡，而NIC能夠加重TAC誘導(dǎo)的細胞凋亡，從而進一步導(dǎo)致腎臟損傷。

綜上，NIC在TAC慢性腎毒性大鼠模型中加重了TAC誘導(dǎo)的腎損傷。氧化應(yīng)激的加重和程序性細胞死亡可能是NIC有害作用的一個潛在機制。