miR-144t通過對肝細胞生長因子的調控抑制肝癌細胞MHCC97H的增殖、遷移及延緩肝癌進展

樊赟 樊紀民 卞華

(1南陽理工學院 河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室，河南 南陽 473000;2河南省南陽市臥龍區中醫藥管理局)

肝細胞癌(HCC)是原發性肝癌(PLC)的病理類型之一，占比達90%以上，肝癌發病率居世界癌癥發病率第五位，致死率居第二位〔1〕，我國肝細胞癌發病率占世界總數的55%〔2〕，且發病率逐年增加。近年，腫瘤分子靶向治療成為肝癌治療的熱點，臨床上細胞分子靶向治療對于肝癌，尤其是晚期階段發揮重要作用〔3〕。肝細胞生長因子(HGF)由肝臟間葉細胞分泌，可調控多種組織及細胞增殖分化，如啟動肝再生、促細胞分裂、運動、抗凋亡等〔4〕。HGF主要通過與c-met形成二聚體，激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)等通路，發揮其生物學功能〔5〕。miRNA是一種單鏈非編碼小分子RNA，它可調控人類基因組中約三分之一基因的表達，研究表明，近一半已知miRNAs與腫瘤相關，發揮致癌或抑癌作用〔6〕。本研通過分析miR-144對靶基因HGF調控作用，為診斷及治療肝癌提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1組織樣本采集 收集2016年12月至2018年5月就診于南陽理工學院附屬醫院病理科確診為肝癌的患者69例，其中男51例，女18例，平均年齡(55.29±8.41)歲。采集肝癌組織及匹配癌旁組織，肝癌組織均由病理學醫師共同診斷，且取樣前未行放化療。

1.2方法

1.2.1標本采集 清晨空腹采集肝癌患者外周靜脈血3 ml，1 000 r/min離心10 min，采集血清，-80℃保存待測。

1.2.2qRT-PCR檢測miR-144表達量 取0.5 ml血清標本，采用Trizol法提取血清總RNA，進行RNA逆轉錄，合成cDNA，進行PCR反應。實驗步驟均按照試劑盒中說明書進行。

1.2.3細胞培養和轉染 肝癌細胞SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2及人肝上皮細胞THLE-3均購自上海中科院細胞庫。測定及比較上述細胞中miR-144表達量、HGF mRNA及蛋白表達。選取MHCC97H細胞進行后續實驗。DMEM培養基(37℃，5%CO2)培養MHCC97H細胞，分為miR-NC組、miR-144組、miR-144+HGF組，分別轉染陰性對照miRNA模擬物(mimics)、miR-144 mimics、miR-144 mimics+HGF，均根據LipofectamineTM2000的轉染試劑說明進行轉染。

1.2.4熒光素酶檢測實驗 經miRNA靶基因數據庫，預測出miR-144與HGF的可能結合位點。構建HGF野生型3′-UTR熒光素酶質粒pMIR-WT和突變型質粒pMIR-Mut。將MHCC97H細胞進行分組，分別轉染野生型質粒pMIR-WT、突變型質粒pMIR-Mut與miR-144 mimics和陰性對照miRNA mimics。檢測各組熒光素酶活性。

1.2.5Western印跡檢測 經分離凝膠蛋白電泳(電壓120 V)與濃縮膠蛋白電泳(電壓80 V)進行蛋白分離，之后進行轉膜，TBST室溫下封閉1 h，加入HGF抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶1 000)，GAPDH為內參，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，電化學發光(ECL)試劑盒(Millipore公司)顯影，凝膠成像系統掃描，Get Image System軟件進行分析。

1.2.6CCK8檢測 將miR-NC組、 miR- 144組及miR-144+HGF組細胞轉染24 h后，接種于96孔培養板，每孔加10 ml CCK8，詳細步驟按照試劑盒說明書步驟進行，480 nm波長處測定OD值。

1.2.7細胞劃痕實驗檢測 將miR-NC 組、 miR- 144組及miR-144+HGF組細胞經胰酶消化，吹打為單細胞懸液，24 h待細胞長成單層棄去培養液，在孔中央進行劃痕，顯微鏡下拍照，測量并計算24 h細胞遷移距離。

1.2.8流式細胞法檢測 取miR-NC組、miR-144組、miR-144+HGF組細胞通過胰蛋白酶消化后，吹打成單細胞懸液，以2×104個/ml濃度接種于24孔培養板中。培養液培養，細胞貼壁后加入50 ng/ml的HGF。待消化后收集細胞，并通過離心棄除上清液，以PBS洗滌2次，緩沖液懸浮細胞，加入膜聯蛋白V，混勻，再加入核酸熒光染料碘化丙啶，混勻后避光反應，流式細胞儀檢測。

1.2.9構建肝癌裸鼠模型 8只裸鼠，75%酒精常規消毒后肢，4號注射針經皮穿刺，將陰性對照miRNA mimics (miR-NC組)，miR-144 mimics轉染(miR-144組)進MHCC97H細胞并注射到裸鼠皮下(0.2 ml，約含細胞2×107個)，正常飼養，每日給藥1次，隔日稱重，10 d后眼球取血，以頸椎脫臼法將其處死，剝取腫瘤組織，置甲醛固定。

1.3統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1肝癌患者細胞中miR-144的表達量 肝癌組織中miR-144表達量明顯低于癌旁正常組織〔(0.28±0.09)vs(1.00±0.21)〕，差異具有統計學意義(t=5.458，P=0.005)。miR-144在THLE-3、SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中的表達量分別為(1.00±0.21)、(0.71±0.17)、(0.34±0.03)、(0.52±0.06)和(0.58±0.13)，組間比較差異有統計學意義(F=9.613，P=0.002)。SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中miR-144的表達量均明顯低于THLE-3，差異均有統計學意義(t=16.335，22.412，18.211，17.336；P均<0.001)。

2.2miR-144通過結合HGF的3′-UTR來抑制HGF的表達 miRNA靶基因數據庫預測結果顯示，HGF為miR-144潛在靶基因(圖1)。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，對于WT-HGF野生型報告基因質粒，miR-144組的熒光素酶活性明顯低于miR-NC組〔(17.61±1.12)vs(33.42±1.37),t=15.47，P=0.001〕。對于Mut-HGF突變型報告基因質粒，兩組熒光素酶活性無顯著差異〔(35.32±3.42) vs (33.42±3.31);t=0.691,P=0.527〕。

miR-144組HGF mRNA表達水平明顯低于miR-NC組〔(0.39±0.05)vs(1.0±0.21)，t=4.894，P=0.0081<0.01〕。Western印跡檢測結果顯示，miR-144組HGF蛋白表達水平較miR-NC組明顯降低，差異有統計學意義〔(0.34±0.13)vs(1.0±0.21)，t=4.628，P<0.01〕。見圖2。上述結果說明，miR-144能夠抑制HGF mRNA及蛋白表達。

圖1 HGF為miR-144的潛在靶基因

圖2 Western印跡法檢測HGF蛋白表達

2.3HGF在肝癌組織及細胞中mRNA及蛋白的表達 HGF在THLE-3、SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中mRNA的表達量分別為(1.0±0.17)、(1.27±0.21)、(1.54±0.26)、(1.47±0.16)和(1.86±0.27)，組間比較差異有統計學意義(F=6.416，P=0.008)。SMCC7721、MHCC97H、LM3和HepG2中HGF mRNA的表達量均明顯高于THLE-3(t=17.554，22.478，25.231，28.406；P均<0.001)。

肝癌腫瘤組織中HGF mRNA表達量明顯高于癌旁正常組織〔(2.32±0.41)vs(1.0±0.23)，t=23.32，P<0.01〕。

免疫組化實驗結果顯示，腫瘤組織中、癌旁正常組織中HGF陽性染色細胞數分別為(125.50±16.66)個/HP、(37.42±3.58)個/HP，HGF在腫瘤組織中的表達量明顯高于癌旁正常組織(t=42.936，P<0.001)，見圖3。以上結果表明，HGF可促進肝癌的發展，而miR-144通過抑制HGF的表達參與肝癌的進展。

圖3 HGF在肝癌組織及癌旁正常組織中的表達(IHC，×25)

2.4miR-144和HGF與細胞增殖，遷移及周期的相關性 miR-NC組、miR-144組、miR-144+HGF組的OD值分別為(0.69±0.15)、(0.58±0.12)、(1.34±0.19)。miR-144組的OD值低于miR-NC組，但差異無統計學意義(t=0.992，P=0.377)。miR-144+HGF組的OD值明顯高于miR-144組，差異有統計學意義(t=5.858，P=0.004)。

流式細胞法檢測發現，miR-144組S期細胞比值〔(14.46±2.33)%〕低于miR-NC組〔(19.11±3.05)%〕，但差異無統計學意義(t=2.098，P=0.104)。而miR-144+HGF組S期細胞比值〔(24.54±2.66)%〕明顯高于miR-144組，差異有統計學意義(t=4.937，P=0.008)。

細胞劃痕實驗結果顯示，12 h后miR-NC組、miR-144組、miR-144+HGF組的細胞遷移個數分別為(185.62±22.33)個、(35.42±6.66)個、(210.33±19.56)個。miR-144組細胞遷移細胞數明顯低于miR-NC組，差異有統計學意義(t=11.164，P<0.001)。miR-144+HGF組細胞遷移數明顯高于miR-144組，差異有統計學意義(t=14.662，P<0.001)。見圖4。以上結果表明，miR-144可抑制肝癌細胞MHCC97H的增殖，遷移和細胞周期在S期聚集，而這些抑制效果可被HGF補回。

圖4 各組細胞遷移實驗(×40)

2.5miR-144抑制裸鼠皮下腫瘤進程 miR-144組腫瘤組織重量明顯低于miR-NC組〔(0.14±0.06) vs (0.52±0.11)g〕，差異有統計學意義(t=7.429，P<0.001)。miR-144在miR-144組中的表達量明顯高于miR-NC組〔(7.56±1.02) vs (1.0±0.12)〕，差異有統計學意義(t=15.65，P<0.001)。HGF在miR-144組中的表達量明顯低于miR-NC組〔(0.38±0.05) vs (1.0±0.13)〕，差異有統計學意義(t=10.922，P<0.001)。

Ki67染色結果顯示，miR-NC組、miR-144組的Ki67陽性染色細胞數分別為(69.35±10.32)個/HP、(16.99±3.47)個/HP，miR-144組的Ki67陽性染色細胞數明顯低于miR-NC組，差異有統計學意義(t=13.602，P<0.001)。見圖5。

HE染色結果顯示，miR-NC組、miR-144組的陽性染色細胞數分別為(112.49±15.02)個/HP、(52.33±6.32)個/HP，miR-144組的陽性染色細胞數明顯低于miR-NC組，差異有統計學意義(t=10.442，P<0.001)。見圖5。以上結果說明miR-144能夠抑制HGF表達并抑制肝癌細胞的增殖。

圖5 miR-144抑制裸鼠皮下腫瘤進程(×40)

3 討 論

目前研究示HCC、肝內膽管癌及混合性肝癌等為PLC主要病理類型，其中HCC占比達90%以上〔7〕。肝癌在發展中國家的發病率遠高于發達國家，我國則是其發病率及死亡率較高的國家之一〔8〕。

miRNA在人類基因表達及腫瘤發生中發揮著重要作用，其中miR-144在多種腫瘤中均發揮抑制作用。研究表明，在肺癌中，miR-144可通過控制凋亡調節因子的表達影響腫瘤細胞的增殖和凋亡〔9〕；在肝癌中，通過對肝癌組織和細胞中檢測發現，miR-144可通過調節轉錄因子(E2F)3的表達，對肝癌細胞的生長產生影響〔10〕。本研究結果證實，miR-144在腫瘤組織比癌旁正常組織中的表達量降低，并且在構建肝癌皮下種植裸鼠模型中，也發現miR-144在肝癌內表達量顯著降低。這表明miR-144對肝癌有相關調控作用。

HGF具有多種生物學功能，常通過自分泌或旁分泌的形式作用于包括腫瘤細胞在內的多種上皮細胞，能刺激肝細胞DNA的合成，促進肝再生，同時還能促進肝癌細胞增殖、運動及血管形成〔11〕。尤其在肝癌切除術后，HGF分泌活躍，誘導特異性跨膜受體c-Met過量表達，促使了肝癌復發，因此抑制HGF/c-met信號傳導通路對減少肝癌復發及轉移發揮著重要作用〔12〕。研究發現，HGF可以激活Bcl-2基因表達、下調Bax蛋白活性，發揮抗細胞凋亡的作用〔13〕。HGF還可通過刺激血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶(MMP)-1及c-Met在血管內皮細胞中的表達，促進腫瘤新生血管形成。HGF/c-Met信號轉導通路在人體內正常細胞向惡性細胞轉化過程中發揮重要作用〔14,15〕。在致癌性轉化過程中Met活性調節可能與正常的c-Met活性調節完全不同。研究發現，Met基因缺失的小鼠表現為因肝臟和胎盤發育嚴重缺陷導致胚胎致死，其特點與小鼠HGF基因缺失表現十分相似。HGF/c-Met信號通路可以在多個胚胎組織中調節形態發生和浸潤性生長〔16〕。本研究結果說明miR-144能夠抑制HGF的表達量并抑制肝癌細胞的增殖，這預示miR-144能夠通過抑制HGF的表達，從而抑制肝癌的發展。

綜上所述，miR-144可抑制肝癌細胞MHCC97H的增殖，遷移和細胞周期在S期聚集，而這些抑制效果可被HGF補回，而miR-144能夠抑制HGF的表達并抑制肝癌細胞的增殖，對肝癌有抑制效果。