中風(fēng)通絡(luò)洗劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張文，黃春英，莫海濤，劉元

（1.玉林市中醫(yī)醫(yī)院，廣西玉林537000；2.廣西艷日輝瑤藥瑤浴產(chǎn)品開發(fā)有限公司，廣西南寧530219）

瑤族醫(yī)藥是祖國醫(yī)學(xué)的一個重要分支，瑤浴是一種富有瑤族特色的防治方法，目前已列入“十一五”國家科技支撐計劃“民族醫(yī)藥發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)示范研究”項目。中風(fēng)通絡(luò)洗劑是根據(jù)廣西金秀瑤族民間治療中風(fēng)后遺癥（偏癱）的有效驗方制成，主要由麻骨鉆（買麻藤）、半荷風(fēng)（半楓荷）、地鉆（千斤拔）、五爪風(fēng)（五指毛桃）、血風(fēng)（走馬胎）、扁骨風(fēng)（扁擔(dān)藤）、九節(jié)風(fēng)（腫節(jié)風(fēng)）、粉葛等藥材組成，具有疏風(fēng)通絡(luò)、活血、除痰的功效。方中朱砂根和走馬胎的主要活性成分為巖白菜素，具有止咳祛痰和抗炎作用，并具有細(xì)胞毒活性［1-2］；腫節(jié)風(fēng)具有祛風(fēng)除濕、活血止痛的功效［3］；粉葛中活性成分葛根素具有顯著的擴(kuò)張冠狀動脈、抗血栓、改善冠狀動脈血流量的作用［4］。為能更好地控制中風(fēng)通絡(luò)洗劑的質(zhì)量，本研究采用TLC法對方中朱砂根和走馬胎、腫節(jié)風(fēng)進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法測定粉葛中葛根素的含量，為制訂中風(fēng)通絡(luò)洗劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC3000I型高效液相色譜儀（北京創(chuàng)新通恒有限公司）；UV3000紫外檢測器（北京創(chuàng)新通恒有限公司）；CXTH-3000色譜工作站（北京創(chuàng)新通恒有限公司）；Agilent-C18柱［4.6 mm×250 mm，5μm，安捷倫科技（中國）有限公司］；KQ5200E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥巖白菜素對照品（批號：111532-201203）；腫節(jié)風(fēng)對照藥材（批號：121048-201205）；葛根素對照品（批號：110752-201615），購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。樣品：中風(fēng)通絡(luò)洗劑，由廣西艷日輝瑤藥瑤浴產(chǎn)品開發(fā)有限公司和玉林市中醫(yī)醫(yī)院制劑室 提 供，批 號：180801、180802、180803、181119、181120、181121。

2 薄層色譜鑒別

2.1 朱砂根和走馬胎的TLC鑒別

2.1.1 對照品溶液的制備取巖白菜素對照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備取本品10 ml，加甲醇20 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備取缺朱砂根和走馬胎的其他藥材，按比例及制備方法制成陰性樣品，取陰性樣品10 ml，同“2.1.2”項方法制成陰性對照溶液。

照薄層色譜法［5］試驗，吸取上述3種溶液各3μl，分別點于同一硅膠G薄層板，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（5∶4∶2）為展開劑展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵-2%鐵氰化鉀（1∶1）溶液，熱風(fēng)吹至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點（Rf=0.51）。陰性無干擾。見圖1。

圖1 朱砂根和走馬胎薄層色譜圖

2.2 腫節(jié)風(fēng)的TLC鑒別

2.2.1 對照藥材溶液的制備取腫節(jié)風(fēng)對照藥材0.5 g，加水30 ml，超聲處理30 min，濾過，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為對照藥材溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取本品30 ml，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備取缺腫節(jié)風(fēng)的其他藥材，按比例及制備方法制成陰性樣品，取陰性樣品30 ml，同“2.2.2”項方法制成陰性對照溶液。

照薄層色譜法［5］試驗，吸取上述3種溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（9∶4∶1）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點（Rf=0.52）。陰性無干擾。見圖2。

圖2 腫節(jié)風(fēng)薄層色譜圖

3 含量測定

3.1 色譜條件色譜柱：Agilent-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；檢測波長：250 nm；流動相：甲醇-水（26∶74）；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫。理論塔板數(shù)按葛根素峰計應(yīng)不低于4 000。

3.2 對照品溶液的制備精密稱取葛根素對照品適量，加30%乙醇制成每1 ml含20μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備精密量取本品溶液5 ml，置25 ml量瓶中，加30%乙醇15 ml，超聲處理30 min，冷卻至室溫，加30%乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖3 HPLC色譜圖

3.4 陰性對照溶液的制備按中風(fēng)通絡(luò)洗劑處方和方法制備缺粉葛的陰性樣品，再按“3.3”項方法制備陰性對照溶液。

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10μl，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果供試品各相鄰峰分離良好，陰性對測定無干擾。色譜圖見圖3。

3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍考察精密稱取葛根素對照品9.73 mg，置25 ml量瓶中，用30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成389.20μg/ml對照品溶液，備用。分別精密吸取上述對照品溶液0.25 ml、0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml，置10 ml量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣測定。0.25 ml的稀釋液進(jìn)樣2.5μl、5μl、10μl，其余進(jìn)樣10μl，測定，以葛根素對照品進(jìn)樣濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸曲線為Y=45 379X+7 975.6，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 8。結(jié)果表明：葛根素進(jìn)樣量在0.024～0.778μg之間與峰面積積分值呈線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗分別精密吸取葛根素對照品溶液（19.46μg/ml）和供試品溶液（批號181120）各10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，依次測定峰面積值，即得。測得對照品RSD為1.42%（n=6），供試品RSD為1.30%（n=6）。

3.7 重復(fù)性試驗精密量取同一批號供試品（批號181120）共6份，按“3.3”項下方法進(jìn)行提取、測定，即得。結(jié)果測得葛根素含量為78.0μg/ml，RSD為1.26%（n=6）。表明該方法重復(fù)性良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗取供試品溶液（批號181120），每隔2 h分別進(jìn)樣10μl測定，結(jié)果供試品的峰面積值RSD為1.30%（n=6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

3.9 加樣回收試驗精密量取已測知含量的同一批號供試品溶液2.5 ml（批號：181120；含量：78.0μg/ml）6份，加入389.20μg/ml葛根素對照品溶液0.5 ml，按供試品制備項下方法進(jìn)行提取，測定。結(jié)果葛根素平均 回收率 為99.0%，RSD為1.40%（n=6），結(jié) 果見表1。

3.10 樣品測定取6批中風(fēng)通絡(luò)洗劑，按供試品溶液的制備及檢測方法，測定其中葛根素的含量，結(jié)果見表2。

4 討論

中風(fēng)通絡(luò)洗劑為民族藥制劑，組方中大多數(shù)藥材為廣西特色瑤藥，本研究以巖白菜素對照品和腫節(jié)風(fēng)對藥藥材為標(biāo)準(zhǔn)品，采用TLC法對方中朱砂根、走馬胎和腫節(jié)風(fēng)進(jìn)行定性鑒別，斑點清晰，重現(xiàn)性好，且陰性無干擾。但由于中國食品藥品檢定研究院沒有更多的標(biāo)準(zhǔn)對照藥材提供，定性試驗還有待進(jìn)一步深入。

表1 加樣回收試驗結(jié)果 （n=6）

表2 樣品中葛根素含量測定結(jié)果 （n=2）

在定量測定中，采用了HPLC法測定粉葛中葛根素的含量，通過對葛根素對照品溶液進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)其在250.50 nm處有最大吸收，最后參照《中華人民共和國藥典》2015年版粉葛項下含量測定方法［6］，選定檢測波長為250 nm。以甲醇-水為流動相，考察了多種比例，最后確定甲醇-水（26∶74）的比例較為適合。采用超聲處理30 min、加熱回流1 h進(jìn)行提取方法考察，二者含量測定結(jié)果差別不大，但超聲處理更簡便、快捷，故采用超聲處理法。對甲醇、乙醇、30%乙醇3種提取溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果用30%乙醇提取所得葛根素的含量高，且節(jié)省溶劑，故采用30%乙醇作為提取溶劑。對10 ml、25 ml、50 ml提取溶劑量進(jìn)行了考察，結(jié)果以25 ml進(jìn)行提取，測得葛根素的含量高且節(jié)省溶劑，故采用25 ml作為提取溶劑量；對超聲處理15 min、30 min、60 min 3種提取時間進(jìn)行考察，結(jié)果超聲處理15 min測得葛根素的含量較低，而30 min與60 min無明顯差別，故提取時間定為30 min。