疏肝解郁法聯合針刺對糖尿病合并抑郁大鼠血糖、胰島素受體及ERK1/2、CaMK 信號通路表達的影響

房 丹

（聯勤保障部隊第九八三醫院和平院區內四科，天津 300020）

糖尿病是由胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗引起的慢性代謝性疾病，其主要特征是慢性高血糖[1]。抑郁癥是糖尿病的主要并發癥之一，隨著生活節奏的加快和社會壓力的增加，糖尿病并發抑郁癥的發生率逐年增高[2]。據相關統計發現，超過3 成糖尿病患者伴有不同程度的抑郁癥狀[3]。糖尿病合并抑郁癥作為一種內分泌和神經系統復合疾病，嚴重影響患者生活質量，且致殘和自殺風險高，常規西醫治療一般采取控制?和抗抑郁等對癥治療，對改善相關癥狀有明顯的作用，但存在病情易復發、不良反應大等不足[4]。目前對于糖尿病并發抑郁癥的作用機制尚未完全明確，研究能夠有效治療糖尿病合并抑郁癥的方法意義重大。

1 實驗材料

SPF級雄性大鼠48只，5周齡，體質量 160～200 g，由省實驗動物中心提供。干凈、清潔環境下，每只大鼠置于隔離單元內籠中飼養，含直徑14 cm 轉輪；溫度22～26 ℃，相對濕度55%～65%，隔音通風且避光，無外界干擾情況下自由攝食、飲水及轉輪活動，光暗同步下飼養1 周。鏈脲佐菌素STZ、β-actin 抗體（Sigma-Aldrich 中國公司）；血糖、胰島素和糖化血紅蛋白試劑盒（北京卓爾恒信科技有限公司）；高脂高糖乳劑：10%膽固醇、20%豬油、30%蔗糖、2%膽酸鈉、38%普通標準飼料；ERK1/2 抗體、CaM 抗體、CaMK Ⅱ抗體（美國Abacm 公司）；PⅤDF 膜（美國Milipore 公司）；蛋白分析試劑盒（美國Bio-Rad 公司）；RT-PCR 引物（深圳市瑞賽生物技術有限公司）；TRIZOL 試劑、一步法RT-PCR 試劑盒（上海一基實業有限公司）；檸檬酸緩沖液、M-MuLⅤ逆轉錄酶（北京百奧萊博科技有限公司）；瓊脂糖（美國Amresco公司）。血糖儀（上海玉研科學儀器有限公司）；Catalyst One? 全自動生化分析儀（美國IDEXX 公司）；MyCycler PCR 擴增儀、Mini-PROTEAN 小型垂直電泳槽、PowerPac Basic 基礎電泳儀、iQ5 實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；SpectroArt 200 紫外分光光度儀（美國WEALTEC 公司）；DK-8B 電熱恒溫水浴箱（上海中庸檢驗設備有限公司）；SpectraMax i3x 多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；H1650R 臺式高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；華佗牌一次性針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司）。疏肝解郁方：柴胡6 g，陳皮6 g，川芎6 g，黨參8 g，白術8 g，茯苓8 g，香附5 g，白芍5 g，甘草3 g。藥材由醫院中藥房提供，冷水浸泡2 h 后兩煎，分別取濾液后合并，水浴蒸發制備成濃縮藥物，含生藥0.35 g/mL。

2 方法

2.1 模型制備與分組 所有大鼠普通飼養1 周，監測血糖，確保其在正常范圍內。隨機選取8 只作為空白組（A 組），給予標準飼料飼養；其余40 只則為造模組，給予高糖高脂飼料飼養。4 周后對大鼠進行稱重，采集血液檢測空腹血糖（FBG）、胰島素（FINS）及相關血生化指標，計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR），確認是否形成胰島素抵抗。造模組所有大鼠禁食12 h后，腹腔內注射STZ 溶液，注射劑量以35 mg/kg為標準。STZ 溶液必須現用現配，注射前將STZ溶解于0.1 mol/L、pH 值4.5 無菌檸檬酸緩沖液中，配制成12 mg/mL 的STZ 溶液。A 組大鼠以同樣標準注射等劑量檸檬酸緩沖液。72 h后采集血液及測量血糖，取3 次測量平均值作為最終結果，FBG ≥16.7 mmol/L則認為糖尿病大鼠造模成功。糖尿病造模成功大鼠均繼續給予慢性孤養和不可預見性中等刺激，具體包括4 ℃冰水浴5 min、45 ℃熱水浴5 min、束縛15 min、噪音8 h、晝夜顛倒24 h、傾籠45°24 h、夾尾1 min 等，每天隨機選取一種刺激，同種刺激不連續出現，形成不可預測的溫和刺激，共刺激4 周，以曠場實驗進行行為學檢測，以大鼠水平運動格數和垂直豎立次數下降與造模前有統計學差異作為造模成功的判定標準，差異性越大，抑郁程度越高。

2.2 治療方法 造模組40例大鼠隨機分為5 組，分別為模型組（B組）、陽性對照組（C組）、針刺組（D組）、疏肝解郁方組（E組）和疏肝解郁方聯合針刺組（F組）。C 組給予臨床等效劑量二甲雙胍（0.18 g/kg）加百憂解（1.8 mg/kg）灌胃治療；D 組統一于每天早上10 點進行針刺治療，取穴：百會（頂骨正中）、后三里（膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm）、三陰交（后肢內踝尖上10 mm），百會穴斜刺2～3 mm，后三里、三陰交直刺2～3 mm，每日1 次；E 組給予疏肝解郁方臨床等效劑量3.5 g/kg 標準灌胃；F 組治療方法為針刺加疏肝解郁方，方法同D 組與E 組。A 組與B 組給予等劑量生理鹽水灌胃。治療7 d 后觀察結果。

2.3 觀察及檢測方法 1）血糖：麻醉后腹主動脈取血，促凝管收集，3 000 r/min 離心分離10 min，取上清液-80 ℃保存待檢，使用全自動生化分析儀檢測FBG、糖化血紅蛋白（HbA1c）及FINS，計算HOMA-IR，所有操作均嚴格執行試劑盒所示要求。2）RT-PCR法檢測胰島素受體（IR）、胰島素底物-1（IRS-1）mRNA 表達：取肝組織50 mg，Trizol 一步法取肺臟組織總RNA，蛋白核酸分析儀檢測RNA 濃度，M-MuLⅤ逆轉錄酶逆轉錄成cDNA，PCR 擴增檢測IR、IRS-1 mRNA 表達，反應條件：95 ℃、30 s，94 ℃、5 min，55 ℃、30 s，70 ℃、1 min，35 個循環；引物序列如下：IR 上游5’-GCTGGACTGTGGTGGATA-3’，IR 下游5’-GTCAGA CTCAAAAGGTGGG-3’，長度419 bp；IRS-1 上 游5’-CCTGGAGTATTATGAGAACGA-3’，IRS-1 下 游5’-TTGGAGCAACTGGATGAA-3’，長度609 bp；取5 μL 擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統灰度掃描。3）Western-bloting 法檢測大鼠海馬組織CaM、CaMK Ⅱ、ERK1/2 含量：大鼠末次治療后斷頭，取新鮮海馬組織，1.5 mL LFP 管中生理鹽水沖洗，充分剪碎后2 500 r/min 離心10 min，去上清；加4 ℃裂解液1 mL，剪碎混勻后低溫超聲勻漿，14 000 r/min，離心5 min 后取上清液；5 μL 上清液加入3 μL 考馬斯亮藍、95 μL 去離子水，測量595 nm 處OD 值，并根據OD 值調整蛋白濃度；待檢測蛋白樣品上樣量：50 μg/孔；電泳條件：12%濃縮膠，90 Ⅴ，30 min；10%分離膠，120 Ⅴ，120 min；NC 膜轉印，轉膜條件：300 mA 恒流，90 min；完全浸沒于5%的的脫脂奶粉TBST 溶液中，搖床2 h,TBS 漂洗5 min，3 次；一抗孵育，4 ℃過夜；二抗孵育，37 ℃1 h；掃描分析結果，曝光時間2 min，CCD 自動獲取圖像，以1:1 000 稀釋的小鼠抗大鼠β-actin 單克隆抗體作為內參，各蛋白相對表達量以條帶與相應蛋白β-actin 灰度值的比值半定量表示。

2.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行分析，計量資料以均值±標準差（）表示，采用方差分析。

3 結果

3.1 各組大鼠FBG、HbA1c、HOMA-IR 水平比較 見表1。

表1 各組大鼠FBG、HbA1c、HOMA-IR 水平比較（，n =8）

表1 各組大鼠FBG、HbA1c、HOMA-IR 水平比較（，n =8）

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05；與F 組比較，▲P ＜0.05

3.2 各組大鼠肝組織IR、IRS-1 mRNA 表達比較 見表2。

表2 各組大鼠肝組織IR、IRS-1 mRNA 表達比較（n =8）

3.3 各組大鼠海馬組織CaM、CaMKⅡ平均灰度值及ERK1/2 平均光密度值比較 見表3。

表3 各組大鼠海馬組織CaM、CaMK Ⅱ平均灰度值及ERK1/2平均光密度值比較（，n =8）

表3 各組大鼠海馬組織CaM、CaMK Ⅱ平均灰度值及ERK1/2平均光密度值比較（，n =8）

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05；與F 組比較，▲P ＜0.05

4 討論

糖尿病作為一種慢性代謝性疾病，可累及多器官、組織，其中對中樞神經系統的影響越來越受到重視[5]。長期血糖控制不良會影響其他物質代謝，并影響中樞神經系統的結構與功能[6]，導致抑郁的發生。抑郁是糖尿病患者常見并發癥，糖尿病合并抑郁癥患者具有高血糖、高血紅蛋白、胰島素抵抗等特征[7]，且上述特征會相互影響，惡化病情。臨床研究顯示，FBG 和HbA1c 與糖尿病患者抑郁發病率關系密切[8]。胰島素抵抗會影響腦組織葡萄糖利用效果，下調神經元興奮性，導致傳輸速度減緩，在糖尿病并發抑郁癥的發病中發揮著重要作用[9]，改善FBG、HbA1c、HOMA-IR水平是糖尿病合并抑郁患者治療的重要步驟。本次研究顯示，糖尿病合并抑郁大鼠模型經疏肝解郁法聯合針刺治療后，FBG、HbA1c、HOMA-IR 水平顯著降低（P＜0.05），與陽性對照組效果相當，表明疏肝解郁法聯合針刺可有效控制大鼠的高血糖，改善胰島素抵抗狀態。

現代醫學認為，下丘腦-垂體-腎上腺軸功能活動亢進，皮質酮（CorT）、促腎上腺皮質激素等水平提高是糖尿病合并抑郁的主要病理生理改變[10]。CorT長期保持高水平會刺激FINS 分泌，加重糖尿病病情。肝臟是葡萄糖產生和利用的主要器官，也是FINS 作用的靶器官[11]，FINS 能和靶細胞表面IR 結合，進而導致一系列的磷酸化活級聯反應，產生FINS的生物效應。任意FINS 信號傳導環節受損均可導致胰島素抵抗的發生[12]，因此，研究胰島素受體對糖尿病合并抑郁大鼠的療效意義重大，本次研究中主要對大鼠肝組織IR、IRS-1 mRNA 表達變化進行研究。本研究結果顯示，大鼠經治療后IR、IRS-1 mRNA 表達顯著升高（P＜0.05），其中F 組和C 組改善效果最為明顯，表明疏肝解郁法聯合針刺能夠提高肝組織 IR、IRS-1 的基因表達，改善FINS 信號傳導。

海馬組織是參與學習記憶、調控情緒的重要部位[13]，也是糖尿病合并抑郁癥發生的重要靶點。“海馬神經元損傷減少”假說是抑郁發病的重要機制之一，海馬神經元損傷及可塑性失調是導致抑郁發生的重要因素[14]。環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）是調節中樞神經系統功能的關鍵分子之一[15]。隨著分子生物學的發展，抑郁癥的發病機制逐漸由細胞外單胺遞質途徑轉向細胞內信號轉導機制。研究顯示，CREB的表達與神經元可塑性直接相關，而CREB 的表達受到多種信號通路的影響[16]，CaMK 信號通路是其中重要途徑之一。CaM 是鈣離子重要的受體蛋白，直接參與神經元的修復，其與鈣離子結合后形成的復合物能夠激活CaMK Ⅱ。CaMK Ⅱ在海馬區內高度表達，對傳遞信息、調節神經可塑性具有重要作用[17]。絲裂原活化蛋白激酶（MARK）通路能調節神經元的增長、凋亡及突觸可塑性，ERK1/2 是其中與抑郁癥關系最為密切的信號通路[18]。本次研究顯示，B 組海馬組織CaM、CaMKⅡ、ERK1/2表達顯著低于A組（P＜0.05），表明糖尿病合并抑郁癥會損傷大鼠海馬神經元，提示下調ERK1/2、CaMK 通路可能是抑郁癥的發病機制之一。C 組和F 組CaM、CaMK Ⅱ、ERK1/2 表達顯著升高（P＜0.05），且與D、E 組有顯著差異（P＜0.05），提示疏肝解郁法聯合針刺能夠影響CaMK、ERK1/2 信號通路，調節海馬神經元再生，發揮抗抑郁作用。

從上述研究發現，疏肝解郁法聯合針刺效果顯著，與陽性藥物一致，表明中醫在糖尿病合并抑郁的治療中具有獨到的優勢。在中醫理論中，糖尿病屬于“消渴”的范疇，歷代醫家認為其發生與發展與情志關系密切。抑郁癥屬于“郁證”的范疇，消渴遷延難愈，情志內傷，則肝氣不舒、郁結于內，郁久化熱，熱灼傷津，耗傷陰津，加重消渴之癥。消渴與郁證共存，二者相互影響，加重疾病的進展。本研究中采用疏肝解郁法聯合針刺治療糖尿病合并抑郁。肝氣郁結是該病早期顯著特點，故采用疏肝解郁之法，方中柴胡疏肝解郁為君藥，臣以川芎行氣活血止痛，香附理氣疏肝，二者合用，助君藥解肝經之郁滯；陳皮理氣行滯，黨參補中益氣、止渴生津，白術、茯苓健脾益氣、燥濕利水，白芍養血柔肝，為佐藥；甘草調和諸藥，為使藥。諸藥同用，共奏疏肝行氣，活血止痛之功。郁證病位在腦，與心肝脾密切相關，本次研究中針刺選擇百會、后三里、三陰交。從心論治，醒腦開竅，心主神，百會位于頭部巔頂，乃諸脈匯聚之處，針刺可調神通督；從肝論治，調節疏泄狀態，三陰交乃肝脾腎匯集之處，針刺可調肝、運脾、健腎；從脾論治，運脾化濕，調暢氣機，后三里可調節脾土。

綜上所述，疏肝解郁法聯合針刺治療糖尿病合并抑郁大鼠的機制可能與改善血糖異常，提高肝組織IR、IRS-1 的基因表達從而改善胰島素的信號傳導，激活ERK1/2、CaMK 信號通路調節大鼠海馬神經元再生有關。