哈蟆油與牛蛙油蛋白質組學差異分析

宿文杰，張玉堯，周 媛，宋柏林，趙大慶，張 鶴,3*

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.寧江社區衛生服務中心，吉林 松原 138000；3.長春中醫院大學附屬醫院，長春 130021）

哈蟆油（Ovicutus Rana）為蛙科動物中國林蛙（Rana temporaria chensinensisDavid）雌蛙的輸卵管，為滋補藥材之首，具有補腎益精、健脾益胃、滋陰補腎、潤肺生津等功效。林蛙的輸卵管[1]呈現乳白色或黃白色，有脂肪樣光澤，手摸滑潤，質硬易折斷；有特殊的油脂氣味和腥味，味微甘，嚼之有黏滑感；膨脹度＞55；其主要成分為蛋白質，含量約占50%以上[2]。偽品牛蛙的輸卵管為不規則彎曲，管徑不均一，不透明的暗黃色，無光澤手摸無滑膩感，質地較硬、脆。牛蛙油溫水浸泡膨脹度＜30，粗蛋白含量為39.96%～47.50%[3]。在目前研究中，偽品牛蛙的輸卵管從性狀、顯微、薄層色譜等方面與哈蟆油均可辨別區分。目前研究哈蟆油中特異性的成分除1-甲基海因外[4]，鮮有特異性成分發現。本文采用iTRAQ 技術比較哈蟆油和牛蛙油的蛋白質表達差異，對這些差異蛋白進行功能分析和代謝通路分析，篩選兩個種屬蛙在冬眠前輸卵管蛋白組成的差異，進而發現這些差異蛋白與生長環境、發育的關系。

1 材料和方法

1.1 樣品采集 林蛙采于蛟河市前進鄉、永吉縣北大湖鎮、舒蘭市上營鎮、樺甸市紅石砬子鎮、集安市清河村、安圖縣三道灣鎮，牛蛙采自于福建省漳州市。

1.2 主要儀器和試劑 Q-Exactive 質譜儀，Thermo Finnigan 公司；AKTA Purifier 100 純化儀，600Ⅴ電泳儀，GE Healthcare 公司；5430R 型低溫高速離心機，真空離心濃縮儀，Eppendorf公司；胰蛋白酶，promega公司；iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit，AB SCIEX 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛙油提取 取活蛙腹部解刨，取兩側輸卵管，去掉筋膜、卵等雜質，用蒸餾水清洗干凈后低溫冷凍干燥，研磨成粉末待用。

1.3.2 蛋白質提取 每組樣品稱取10 mg，加入1 mL SDT 裂解液，充分勻漿后沸水浴5 min，超聲破碎，14 000 g 離心45 min，取上清-80℃保存。SDS-PAGE法測定樣品中蛋白含量。

1.3.3 iTRAQ 定量 每份樣品各取250 μg，胰蛋白酶消化，酶解后的肽段用8 標iTRAQ 試劑標記113（哈蟆油），114（哈蟆油）和117（牛蛙油）。采用第一維強陽離子交換液相色譜分級，第二維采用納升流速HPLC 液相系統進行分離，每份樣品經毛細管高效液相色譜分離后用質譜儀進行質譜分析。

1.3.4 差異蛋白篩選 對樣本哈蟆油113（A）和114（B）與牛蛙油117（E）中1 220 個蛋白質定量信息進行顯著性分析，其中篩選條件標準為比值＞1.5（或比值＜0.67），且P值＜0.05。

1.3.5 生物信息學分析

1.3.5.1 GO 功能注釋分析 利用WEGO 軟件對鑒定到的差異蛋白進行細胞組分、生物學途徑和分子功能分析，計算中GO 選擇Level2 進行匯總。

1.3.5.2 KEGG 通路注釋 利用KAAS 將目標蛋白序列與KEGG GENES數據庫中的兩棲綱蛋白序列進行比對，通過同源/相似蛋白的KO號注釋到相關KEGG通路上。

2 結果

2.1 牛蛙油與哈蟆油差異蛋白篩選的結果 見表1，見表2。

表1 牛蛙油與哈蟆油相比上調的蛋白質

表1 （續）

表2 牛蛙油與哈蟆油相比下調的蛋白質

2.1.1 牛蛙油含量較高的特異性蛋白 從表1 可以看出，牛蛙油與哈蟆油蛋白質組數據分析中上調的蛋白質共計69 個。其中參與生長發育相關的Ada2、Fam3c、Ovch2、Ahnak、Cp、Nup93、Calm2、Capns2、H2az2、H3.2、TGas113e22.1、H2A-IX、Eef1A、Arl1、Iebf2 等；參與能量代謝的蛋白包括Hadhb、Atp5g1、Aldoc 等；參與應激反應的蛋白包括Ldha、Hyou1、Cp、Hpx、Hsp90b1、HSP90B1 等；參與骨架形成的蛋白包括Keratin、Actin、Cfl1、Tubulin等；參與信號轉導的蛋白包括Psme1、Psma7-b、TM9SF1、Sort1 等；參與免疫調節的蛋白包括Mug2、ColIA1、ColIA2、ColⅤA1 等；參與氧化還原的蛋白包括Prx、Sqor 等。

2.1.2 哈蟆油含量較高的特異性蛋白 從表2 可以看出，牛蛙油與哈蟆油相比下調的蛋白質有8 個，其中參與免疫調節的蛋白包括Akap13、Fcgbp、Muc5AC、Muc2、Muc5B 和tPCase 等。

2.2 GO 注釋分析結果 利用WEGO 軟件對鑒定到的差異蛋白功能類別進行GO 功能富集計算。在Level 2水平上對差異蛋白在細胞組分、生物學途徑和分子功能中分布情況進行分析。見圖1。

從圖1 細胞組分中可以看出差異蛋白主要集中在細胞、細胞器、大分子復合體和胞外區等9 個蛋白類，其中細胞、細胞器類和大分子復合體蛋白質的數量最多，分別占所有差異蛋白質的27.92%、22.08%和16.88%。

從圖1 生物學途徑中看出，細胞過程、代謝途徑、單一生物過程、生物調節、定位途徑、繁殖途徑、生長過程和運動過程等是差異蛋白質比較集中的17 個生物學途徑。其中細胞過程、代謝途徑、單一生物過程和生物調節類蛋白質數量較多，分別占所有差異蛋白的17.98%、16.10%、14.61%和10.86%。

圖1 牛蛙油與哈蟆油差異蛋白GO 分析

從圖1分子功能中可以看出結合功能、催化活性、結構分子活性、受體活性、抗氧化活性、酶調節活性等是差異蛋白質比較集中的11 個分子功能。其中結合功能與催化活性類蛋白質數量最多，占所有差異蛋白質的51.04%和29.17%。

2.3 KEGG 代謝通路分析 牛蛙油與哈蟆油的差異蛋白總數為77 個，共提取到41 個差異蛋白map 到100條KEGG 信號通路。41 個差異蛋白中包括40 個上調蛋白map 到99 個KEGG 代謝通路和1 個下調蛋白map 到1 個KEGG 代謝通路。

與哈蟆油蛋白質數據比，牛蛙油中含量較高的Calm2 參與Rap1 信號通路、心肌細胞腎上腺素能信號通路、鈣信號通路等30 個代謝通路；Aldoc 參與糖酵解、糖異生、果糖和甘露糖等7 個代謝通路；Hadhb參與脂肪酸延長、脂肪酸降解、脂肪酸代謝等5 個代謝通路；Ldha 參與糖酵解、糖異生、丙酮酸代謝、丙酸鹽代謝4 個代謝通路。

哈蟆油中含量較高的1 個差異蛋白tPCase 參與氨基糖和核苷酸糖代謝過程。

3 討論

3.1 生活習性差異 中國林蛙是典型的水陸兩棲性生物，它的年生活周期可分為水生生活期和陸生生活期[5]。中國林蛙冬眠分為3 個階段：入蟄期、散居冬眠期、冬眠活動階段[6]。冬眠前機體營養儲備充足，為長期休眠和翌年的排卵提供良好的營養條件。冬眠期蛙類機體的營養水平、代謝水平、內分泌水平等都處于最低水平，減少能量的消耗[7]。

牛蛙的適應能力強，生長速度快，蛋白質含量高等優點，具有較高的食用和經濟價值。由卵孵化成蝌蚪，由蝌蚪變化到成體，共需4～5 年；氣溫降至10 ℃以下，牛蛙開始藏匿于洞穴或淤泥中，停止活動與攝食，進入冬眠期。多數牛蛙均為南方養殖，因此冬眠期較短[8]。冬眠前機體的能量富集以維持蛙冬眠的整個階段和冬眠后的繁殖。由于中國林蛙與牛蛙的生活習性的不同，通過比較牛蛙油和哈蟆油蛋白質組數據庫，篩選兩個種屬蛙在冬眠前輸卵管蛋白組成的差異，進而發現這些差異蛋白與生長環境、發育的關系。在牛蛙油中高表達的69 個蛋白質主要參與生長發育、能量代謝、應激反應、細胞骨架形成、生物合成、信號轉導、免疫調節和氧化還原等過程。而在哈蟆油中高表達的蛋白質有8 個，主要參與免疫調節等過程。

3.2 哈蟆油特異性膨脹度 哈蟆油具有較高的膨脹度是哈蟆油區別于其他偽品蛙油的重要的鑒別方法。本文通過篩選發現黏蛋白類成分Muc2、Muc5AC、Muc5B 和類似黏蛋白Fcgbp 在哈蟆油中含量較高，這三種類型的黏蛋白屬于凝膠形成型的黏蛋白，高度糖基化的黏蛋白具有相當的保水能力，并通過吸收大量水分形成凝膠[9]；黏蛋白結構中包含半胱氨酸富含區域中，C 端D 結構域形成二硫鍵連接形成二聚體，N端的D 結構域形成二硫鍵參與的三聚體，進而形成黏蛋白的分子量較高不溶于水的特點[10]。因此哈蟆油具有較高的膨脹度與哈蟆油中含量較高的黏蛋白類成分密切相關。

3.3 結論 由于中國林蛙與牛蛙的生活習性的不同導致哈蟆油與牛蛙中蛋白質含量的差異，本研究通過比較牛蛙油與哈蟆油蛋白質組數據的差異，篩選哈蟆油中含量較高的8 個差異蛋白主要參與免疫調節等過程；牛蛙油中含量較高的69 個差異蛋白主要參與生長發育、能量代謝、應激反應、細胞骨架形成、信號轉導、免疫調節和氧化還原等過程；其中Akap13、Fcgbp、Muc5AC、Muc2、Muc5B 等8 個高表達的蛋白可作為哈蟆油區別于牛蛙油的重要蛋白質，同時哈蟆油的特異性膨脹度可能與含量較高的黏蛋白類密切相關，本文的研究結果為進一步研究哈蟆油的功效成分奠定基礎。