鐵皮石斛多糖對糖尿病性白內障大鼠氧化應激及ERK信號通路的影響

張曄，胡艷紅，柯發杰，陳勝，陳子揚，胡俊

隨著科技水平及生活水平的不斷提高，糖尿病的發病率逐年提升，預計到2040年，全球糖尿病患者將達到6.42億[1]。作為糖尿病致盲病中的第二大并發癥糖尿病性白內障，其治療仍以眼科手術為主。但如果是老年人和高血糖情況下更易發生如感染、角膜水腫和眼壓增高等諸多術后并發癥，且有些人因自身其他原因不能手術。近年來研究糖尿病性白內障的發病機制已成為眼科領域的熱點，其中氧化損傷無疑是研究的熱門[2-3]，而氧化應激與絲裂原活化蛋白激酶MAPK信號通路的ERK、Raf等活化密切相關[4-5]。鐵皮石斛中的活性成分鐵皮石斛多糖（dendrobium officinale polysaccharide，DOP）有抗氧化、降血糖、抗細胞凋亡、抗腫瘤等作用[6]。本研究應用鏈脲菌素（streptozocin，STZ）建立糖尿病大鼠模型，檢測DOP對糖尿病性白內障大鼠血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧歧化物酶（superoxide dismutase，SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力的變化，晶狀體ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras mRNA的表達水平，以明確DOP對糖尿病性白內障大鼠抗氧化作用的影響及其可能的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級Wistar雄性大鼠50只，體重（180±20）g（福建省中醫藥研究院提供，許可證號：SCXK (閩)2012-0001），實驗動物條件符合《實驗動物管理條例》 要求。實驗動物飼養于濕度60%±10%和溫度（25±1）℃的環境中。實驗過程中對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》的要求，并經福建省中醫藥研究院動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器

DOP（批號:S20181201，純度≥85%）和STZ（批號:Sigma8050-20180601，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；MDA試劑盒（批號:20181012），SOD試劑盒（批號:20181112）和GSH-Px試劑盒（批號:20191102）均購自福州安布瑞生物科技有限公司；熒光定量PCR儀（美國ABI，7300）。

1.3 分組與建模

50只Wistar大鼠，經裂隙燈顯微鏡檢查所有大鼠雙眼晶狀體均透明。隨機分5組，對照組（control group，CG）、模型組（model group，MG）、鐵皮石斛多糖低（DOP low dose，DOPL）、中（DOP medium dose，DOPM）、高（DOP high dose，DOPH）劑量組，每組10只。模型組與DOP組大鼠建立糖尿病模型，4組大鼠均給予禁食不禁水12 h以上，按50 mg·kg-1體質量腹腔注射用檸檬酸緩沖液配制的10 g·L-1的STZ，對照組注射等量的檸檬酸緩沖液。注射2 h后喂食，72 h后取尾血測隨機血糖，血糖≥11.1 mmol/L者為糖尿病模型造模成功，取血糖值11.1～16.7mmol/L大鼠進行實驗。分別在造模前、后對所有大鼠進行裂隙燈檢查晶狀體透明度，晶狀體混濁者為糖尿病性白內障。

DOPL、DOPM、DOPH組分別給予DOP 25、50和100 mg·kg-1灌胃，對照組（CG）、模型組（MG）按相同容量生理鹽水灌胃，每日2次，時間為上午9點和下午3點，以維持一定的血藥濃度，且灌胃前后2 h禁止飲食，其余時間正常喂養。共用藥12周。

12周后處死大鼠，摘除眼球，在顯微鏡下后入路剪除眼球后壁，完整分離出晶狀體組織，用生理鹽水漂洗后液氮速凍，于-80℃冰箱中保存備用，每組10個樣本進行檢測。

1.4 晶狀體混濁程度評定

12周后在裂隙燈下觀察晶狀體，并使用晶狀體混濁分類系統（lens opacities classification system II，LOCS II）方法評定晶狀體混濁程度[7]。評定標準如下：C0，皮質透明；Ctr，皮質少量點狀混濁；C1，皮質點狀混濁擴大，瞳孔區內出現少量點狀混濁；C2，皮質車輪混濁，超過兩個象限；C3，皮質車輪狀混濁擴大，瞳孔區約50%混濁；C4，瞳孔區90%混濁；C5，混濁程度超過C4。N0，透明核，胚胎核清楚可見；N1，早期核混濁；N2，中等程度核混濁；N3，嚴重核混濁。

1.5 氧化應激指標檢測

12周后，腹腔靜脈采血，用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法檢測大鼠血清中MDA、SOD、GSHPx的活性，具體操作按試劑盒說明操作：酶標板加入標準品，每孔加入血清樣本100 μL，37℃下孵育20 min，洗滌液洗滌3次；加入顯色劑，避光顯色5 min，加入終止液50 μL，在酶標儀412 nm測GSH-Px光密度值（optical density，OD），在酶標儀450 nm測MDA、SOD的OD值，計算樣品濃度。

1.6 晶狀體組織中ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras基因表達

采用熒光定量PCR檢測：用Trizol試劑提取并純化晶狀體RNA，并逆轉錄成cDNA。20 μL反應體系中含有:2×plus SYBR real-time mixture 10 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA模板2 μL、重蒸水6.8 μL、ROX I 0.4 μL。95 ℃預變性30 s后，進入40個循環:95 ℃×10 s、56 ℃×30 s、72 ℃×30 s，最后95 ℃×15 s、60℃×1 min、95℃×15 s、60℃×15 s。檢測ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras基因表達時以GAPDH作為內參（表1）。采用2-ΔΔCt方法用于比較每組中各基因的表達水平,ΔCT=CTERK1/ERK2/MEK/Raf/Ras-CTGAPDH，ΔΔCT=ΔCTMG組-ΔCTCG組，ΔΔCT=ΔCTDOP組-ΔCTMG組。所有PCR一式三份進行，并通過熔解曲線對單峰的存在進行驗證。

1.7 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗進行。計數資料采用Kruskal-Wallis檢驗。當P＜0.05時，則認為差異具有統計學意義。

表1 RT-qPCR引物序列

2 結果

2.1 各組大鼠晶狀體混濁程度對比

注射STZ后12周在裂隙燈下大鼠晶狀體照相及混濁評定結果，可見對照組晶狀體混濁評定幾乎都在C0N0，模型組絕大多數晶狀體混濁程度在C3-4、N1-2，DOP組晶狀體混濁程度評定大部分在C1-2、N0-1，對照組大鼠晶狀體基本未發生混濁，保持透明；模型組晶狀體幾乎完全混濁；DOPH組晶狀體出現絮狀、片狀等部分混濁，混濁程度較模型組明顯減輕（表2、圖1）。三組間比較，差異有統計學意義（χ2皮質=49.401，χ2核=43.914，均P=0.000）。

2.2 DOP對糖尿病大鼠血清中氧化應激指標的影響

MDA含量：模型組大鼠血清MDA含量較對照組明顯升高，差異有統計學意義（t=4.615,P=0.000），DOP作用后大鼠血清MDA含量較模型組明顯下降，DOP劑量越高，MDA含量下降越明顯，組間比較差異均有統計學意義（tDOPL=4.046，tDOPM=6.504，tDOPH=6.587,均P=0.000）。

GSH-Px活力：模型組大鼠血清GSH-Px較對照組升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），DOPL組和DOPM組與對照組和模型組差異均無統計學意義（P＞0.05），DOPH組較對照組（CG）和DOPL組明顯升高，差異有統計學意義（tCG=2.728，P=0.011；tDOPL=2.068，P=0.048）。

SOD活力：模型組大鼠血清SOD活力較對照組明顯降低，差異有統計學意義（t=9.809,P=0.000），DOP作用后，DOPL組與模型組差異無統計學意義（P＞0.05），DOPM和DOPH組均較模型組升高，差異有統計學意義（tDOPM=2.914，P=0.007；tDOPH=13.305,P=0.000），但DOPM組與DOPH組之間差異無統計學意義（P＞0.05）（表3）。

2.3 DOP對糖尿病大鼠晶狀體ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組（MG）、DOPL組、DOPM組的ERK1 mRNA呈高表達，差異有統計學意義（tMG=4.569，P=0.000；tDOPL=2.072，P=0.041；tDOPM=2.423，P=0.017）；隨著DOP濃度增高，ERK1 mRNA表達水平逐漸降低，DOPH組ERK1 mRNA表達水平較對照組更低，差異有統計學意義（t=7.849，P=0.000）；與對照組比較，模型組、DOPL組、DOPM組的ERK2 mRNA呈高表達，差異有統計學意義（tMG=3.710，P=0.000；tDOPL=2.542，P=0.013；tDOPM=2.934，P=0.024）；隨著DOP劑量增高，ERK2 mRNA表達水平逐漸降低，DOPH組ERK2 mRNA表達水平與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與對照組比較，模型組與DOP三個劑量組的MEK mRNA呈高表達，差異均有統計學意義（tMG=4.091，P=0.000；tDOPL=4.046，P=0.001；tDOPM=4.493，P=0.000；tDOPH=4.403，P=0.000）；但模型組與DOP三個劑量組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與對照組比較，模型組、DOP三個劑量組的Raf mR-NA呈高表達，差異有統計學意義（tMG=4.546，P=0.000；tDOPL=2.911，P=0.036；tDOPM=6.195，P=0.000；tDOPH=8.494，P=0.000）；隨著DOP濃度增高，Raf mRNA表達水平逐漸降低；與對照組比較，模型組、DOPM組的RasmRNA呈高表達，差異有統計學意義（tMG=3.083，P=0.020；tDOPM=4.297，P=0.000）；DOPM組的Ras mRNA表達水平較DOPL組升高，差異有統計學意義（t=2.913，P=0.036）（表4）。

表2 DOP對糖尿病大鼠晶狀體混濁程度的影響（眼只數，n=20）

圖1 各組晶狀體在體裂隙燈顯微鏡下照片（×10）。1A對照組；1B模型組；1C DOPH組。DOPH鐵皮石斛多糖高劑量組

表3 DOP對糖尿病大鼠血清中氧化應激指標的影響（，n=10）

表3 DOP對糖尿病大鼠血清中氧化應激指標的影響（，n=10）

注：* 與對照組比較，P＜0.05；▲與模型組比較，P＜0.05；# 與DOPL組比較，P＜0.05；△與DOPM組比較，P＜0.05；MDA丙二醛；SOD超氧歧化物酶；GSH-Px谷胱甘肽過氧化物酶；DOPL鐵皮石斛多糖低劑量組；DOPM鐵皮石斛多糖中劑量組；DOPH鐵皮石斛多糖高劑量組

3 討論

糖尿病性白內障是糖尿病第二大眼部并發癥，因其高發病率和高致盲率，糖尿病性白內障成為越來越多的學者研究的熱點。目前，對于糖尿病性白內障的發病機制尚未完全明確,主要有多元醇滲透學說、氧化損傷學說和晶狀體蛋白非酶糖基化學說，其中氧化應激在糖尿病性白內障的發生發展過程中意義尤為重要。糖尿病性白內障的產生與高糖環境下機體內活性氧及其代謝產物、衍生的活性物質等增多，抗氧化酶相對不足，或氧化物與抗氧化物間的比例失調密切相關[8]。

糖尿病性白內障屬中醫學“消渴病圓翳內障”范疇，晶珠屬腎，肝藏血，腎藏精，肝血依賴腎精的滋養，腎精亦賴肝血才能化生。若肝腎不足，臟腑精血之氣不能上榮于目，導致晶珠失養，則易生內障，“因知肝腎無邪，則目決不病”，說明肝腎不足，陰精虧損是本病的主要病因。鐵皮石斛味甘微寒，歸胃、腎經，具有益胃生津、滋陰清熱等功效，主治熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸勞熱等癥。DOP是鐵皮石斛主要成分之一，其現代藥理作用廣泛，如DOP能夠顯著提高糖尿病小鼠肝臟和胰腺的抗氧化能力，修復肝臟和胰腺氧化損傷，從而提高胰島素含量和緩解胰島素抵抗，具有降血糖的作用。同時，DOP也有改善糖尿病小鼠血脂代謝紊亂、改善腎臟損傷的作用；DOP可通過清除羥基自由基從而抑制其誘導的SH-SY5Y細胞凋亡；其還具有增強免疫、抗腫瘤等作用[6]。

本研究結果發現，STZ注射后的糖尿病性白內障模型組大鼠血清SOD活力較對照組下降，MDA含量較對照組升高，SOD是生物體內天然的超氧化物陰離子自由基（）清除劑，它能使變為H2O2與O2，MDA是膜脂質過氧化最重要的產物之一，說明高糖可通過氧化損傷介導糖尿病性白內障的產生。而DOP作用后，SOD活力增強，MDA含量降低，說明DOP可能通過減輕晶狀體的氧化損傷從而防治糖尿病性白內障。這與既往學者的報道一致[9-10]。本研究結果還發現模型組GSH-Px雖然升高，但與對照組比較并無統計學意義，研究結果與其他學者[11-12]的STZ注射后的糖尿病大鼠的GSH-Px活力值升高不同，考慮可能因為GSH-Px值的影響因素較多，如體內硒類物質的蓄積、底物GSH的量等[13]。但從目前臨床上關于糖尿病患者紅細胞GSH-Px活力值報道也存在不一致，糖尿病患者GSH-Px可升高也可降低[14-15]，具體原因尚需進一步實驗研究證實。本研究中在觀察DOP對糖尿病性白內障大鼠氧化應激相關的ERK信號通路活化中關鍵分子mRNA表達時發現，STZ誘導的糖尿病性白內障大鼠晶狀體組織中Ras、Raf、MEK、ERK1/2的基因表達水平均高于對照組。經不同濃度的DOP干預后，ERK1、ERK2和Raf的基因表達隨濃度升高而降低，這種變化規律與MDA和SOD的變化一致，且與黃亞琳等[16]的研究結果一致，說明DOP可能通過介導ERK/Raf信號通路減輕糖尿病大鼠晶狀體的氧化損傷。

表4 DOP對糖尿病大鼠晶狀體ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras的mRNA表達的影響（，n=3）

表4 DOP對糖尿病大鼠晶狀體ERK1、ERK2、MEK、Raf、Ras的mRNA表達的影響（，n=3）

注：* 與對照組比較，P＜0.05；▲與模型組比較，P＜0.05；# 與DOPL組比較，P＜0.05；△與DOPM組比較，P＜0.05；DOPL鐵皮石斛多糖低劑量組；DOPM鐵皮石斛多糖中劑量組；DOPH鐵皮石斛多糖高劑量組

綜上所述，DOP可通過降低糖尿病大鼠血清中MDA含量，提高血清中SOD的活力，增強其抗氧化能力，其中氧化應激介導的ERK/Raf信號通路可能是DOP延緩糖尿病性白內障的重要機制之一。