鹽藻鈣調素基因的克隆及表達分析

王明芳，高相楠，徐微微，叢玉婷，柴曉杰

( 大連海洋大學，遼寧省省級高校水生生物學重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)是一種無細胞壁的單細胞真核生物[1]，屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、多鞭藻科、鹽藻屬，又稱鹽藻，其具有極強的耐鹽能力，廣泛分布于海洋、鹽田及鹽湖中，能夠在NaCl濃度為0.05～5.0 mol/L的培養液中生長、繁殖。簡單的細胞結構和極強的耐鹽性，引起了生物學家的廣泛關注[1]。多年來，國內外學者對鹽藻適應高鹽環境的滲透調節[2-4]、耐鹽基因[5-6]、鹽藻轉錄組[7-9]、miRNA組[10]及蛋白質組[11-12]等方面進行了研究，取得了一些重要研究成果。但是到目前為止，關于鹽藻應答鹽脅迫信號的分子機制尚未完全查明。

鈣調素(CaM)廣泛存在于真核細胞中，是一種分布最廣、功能最重要的鈣依賴性調節蛋白。研究者已經從蘋果、擬南芥、馬鈴薯、水稻、小麥、綠藻中分離出鈣調素基因，在高等植物中至少存在6～12種鈣調素基因。鈣調素是一種小分子量的單鏈的可溶性球蛋白，其中心有一個靈活的螺旋區，該螺旋區連接兩個球形區。每個球形區域均具有2個EF-hand結構域，與Ca2+正向結合[13-14]。在模式植物擬南芥基因組中發現有7個基因編碼鈣調素蛋白，該蛋白家族保守區含有4個EF-hand結構域，與游離態Ca2+結合[15]。鈣調素自身并沒有酶活性，必須經過Ca2+激活后，才能進一步與其靶蛋白結合，將鈣信號向下游傳遞[16]，從而調控植物細胞分裂[17]、生長發育[18-19]、抗逆[20]等生物學過程。目前，尚未見關于鹽藻鈣調素的結構和功能的報道。因此，深入探討鹽藻鈣調素基因的結構與功能對于闡明鹽藻響應鹽脅迫信號的分子途徑具有重要的科學意義。

筆者采用RT-PCR和RACE技術克隆鹽藻鈣調素基因，對其進行生物信息學分析，并應用qRT-PCR方法對鹽脅迫條件下鹽藻鈣調素基因的表達模式進行研究，為進一步闡明鈣調素在鹽藻應答鹽脅迫信號傳遞中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鹽藻藻種由大連海洋大學水生生物學實驗室提供。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α由本實驗室-80 ℃保存，pMDTM18-T vector購自TaKaRa(寶生物)公司。

RNAiso Plus、DNA Marker DL-2000、限制性內切酶(BamH Ⅰ、Hind Ⅲ)、Taq酶、溶菌酶、IPTG、X-gal、DEPC、PrimeScriptTMRT Master Mix、TB Green?Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司。SMART?RACE 5′/3′ kit、NucleoSpin?Gel and PCR Clean-up試劑盒購自Clontech公司。柱式質粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為國產分析純。鹽藻鈣調素基因克隆所用引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Lists of primer sequences

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽藻的培養與鹽脅迫處理

向300 mL無菌海水中加入固體NaCl至終濃度1 mol/L，再加入鹽藻培養液(康威方營養液)300 μL，25 ℃，光照度1250 lx，12L∶12D交替靜置培養，培養5～7 d至對數生長期(藻種密度達到107)，再向培養液中加入固體NaCl，使其終濃度達到3 mol/L，脅迫1 h。

1.2.2 鹽藻總RNA的提取與反轉錄

取處于對數生長期的鹽藻20 mL離心收集藻細胞，按照RNAiso Plus試劑盒操作說明書提取總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。按照SMART?RACE 5′/3′ kit說明將鹽藻總RNA反轉錄合成cDNA。

1.2.3 鹽藻鈣調素基因的 5′、3′- RACE擴增

根據本實驗室對鹽藻轉錄組測序(美國國立生物技術信息中心SRA數據庫：PRJNA471570)獲得的鈣調素基因序列，使用美國國立生物技術信息中心的Primer BLAST設計5′-RACE和3′-RACE特異性引物M1和M2(表1)。3′-RACE的擴增以反轉錄的cDNA為模板，M2和Long primer為引物，進行第一輪擴增。PCR反應條件：94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，25個循環。以第一輪PCR產物稀釋100倍為模板，M2和Short primer為引物，進行第二輪擴增。PCR反應條件：94 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸2 min。 將獲得的3′-RACE擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、連接及轉化，陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。5′-RACE擴增的引物，擴增條件和3′-RACE相同，獲得了5′-RACE擴增產物(圖1)。

1.2.4 鹽藻鈣調素開放閱讀框的擴增

利用DNAman軟件對中間段序列及3′端序列、5′端序列進行拼接，根據得到的鹽藻鈣調素基因全長序列設計1對引物(表1)，以總RNA反轉錄的cDNA為模板，F1和F2為引物進行PCR擴增，PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物經凝膠電泳、膠回收、連接、轉化及測序。

1.2.5 鹽藻鈣調素基因的生物信息學分析

利用美國國立生物技術信息中心數據庫ORF Finder在線軟件(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)進行開放閱讀框的查找；利用DNAman軟件分析鈣調素基因的核酸序列組成；利用Expasy軟件包中的ProtParam(http:∥www.expasy.ch/tools)進行相對分子質量、氨基酸組成、等電點、疏水性等基本理化性質分析；利用ProtComp 9.0(http:∥linux1.softberry.com)進行蛋白質的亞細胞定位分析，使用默認參數；利用KinasePhos(http:∥kinasephos.mbc.nctu.edu.tw)軟件進行蛋白質信號肽分析和磷酸化位點預測；利用SMART軟件(http:∥smart.embl-heidelberg.de/smart)進行保守結構域和功能區分析；利用SOPMA軟件https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html進行蛋白質二級結構預測；利用SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org)進行蛋白質三級結構預測；利用美國國立生物技術中心數據庫中的Blastp軟件進行同源性分析；利用MEGA 7軟件的鄰接歸并法構建進化樹，自展檢驗重復1000次。

1.2.6 qRT-PCR檢測不同時間鹽脅迫下鹽藻鈣調素基因的表達情況

使用RNAiso Plus提取未脅迫(對照組)、鹽脅迫(3 mol/L NaCl)5 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h的鹽藻總RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒將其反轉錄為cDNA。用Premier 5.0軟件設計鹽藻鈣調素基因的特異性qRT-PCR引物：F，ATGACCTCCAAGATGGGCGA，R，AAGC GTGATGAAGCCTGTGT；選取鹽藻18S rRNA基因為內參基因，并設計相應的特異性擴增引物：18S-sense，TTGGGTAGTCGGGCTGGTC，18S-anti-sense，CGCTGCGTTCTTCATCGTT。應用TB Green?Premix Ex TaqTM在96孔板中進行目的基因的qRT-PCR反應，每個PCR反應獨立重復3次。采用2-△△Ct法計算基因的相對表達量，應用SPSS軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 鹽藻鈣調素基因的克隆

2.1.1 鹽藻鈣調素基因3′末端和5′末端的擴增

以鹽藻為材料提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1a，兩條清晰、完整的條帶分別為28S rRNA和18S rRNA，所提取的RNA質量較好。根據本實驗室對鹽藻轉錄組測序獲得的鈣調素基因序列設計特異性引物，進行5′-RACE和3′-RACE的擴增，擴增產物的電泳結果見圖1b、c。在250～500 bp之間有一條清晰的條帶，經測序，獲得一條423 bp的核苷酸序列(圖1b)。在接近1000 bp處有一條清晰的條帶，經測序，獲得一條856 bp的核苷酸序列，并且含有poly A尾結構(圖1c)，確定鹽藻鈣調素基因的3′-末端擴增成功。

2.1.2 鹽藻鈣調素基因開放閱讀框的擴增

將5′-末端序列、中間段及3′-末端序列用DNAman軟件拼接得到一條全長為1061 bp的核苷酸序列，包括5′-UTR為115 bp和3′-UTR為451 bp，可以編碼164個氨基酸的ORF序列為495 bp，起始密碼子是ATG,終止密碼子是TAG。根據DNAman軟件拼接得到的鹽藻鈣調素全長基因序列設計一對引物，擴增產物電泳結果見圖1d，約在500 bp處有一條清晰的條帶，經測序獲得一條495 bp的核苷酸序列，與預期結果完全一致。成功克隆的鹽藻鈣調素(DsCaM)基因序列的GenBank登錄號為MN428415。

2.2 鹽藻鈣調素基因的生物信息學分析

2.2.1 鹽藻鈣調素基因的基本理化性質分析

鹽藻鈣調素基因編碼氨基酸的理化性質分析顯示,鹽藻鈣調素分子式為C791H1247N211O271S10，氨基酸數為164，相對分子質量為18 369，pI為4.20，帶負電荷殘基總數(天冬氨酸Asp+谷氨酸Glu)為38，帶正電荷殘基總數(精氨酸Arg+賴氨酸Lys)為15，原子總數為2530，不穩定系數為26.57，表明鹽藻鈣調素為穩定蛋白質。脂肪系數為72.62，親水性評估為-0.534，根據氨基酸分值越低親水性越強的規律，表明該蛋白為親水性蛋白。組成鹽藻鈣調素多肽鏈的18種氨基酸中，谷氨酸最多，所占比例為14%。鈣調素基因cDNA全長序列和翻譯的氨基酸序列見圖2，黑色方框標出的是起始密碼子和終止密碼子。

圖1 鹽藻鈣調素基因PCR產物凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification products of DsCaM genea.鹽藻總RNA； b.5′-RACE擴增產物； c.3′-RACE擴增產物； d.鹽藻鈣調素開放閱讀框的擴增產物； M.DL2000 marker.a.total RNA of green alga D. salina； b.5′-RACE amplification product； c.3′-RACE amplification product； d. amplified product of the open reading frame of DsCaM; M.DL2000 marker.

圖2 鹽藻鈣調素基因cDNA全長序列和翻譯的氨基酸序列Fig.2 Full-length of cDNA and deduced amino acid sequences of DsCaM gene

2.2.2 鹽藻鈣調素的亞細胞定位及功能域的預測

鹽藻鈣調素信號肽分析結果顯示，其D值為0.102，根據D=0.450是區分信號肽和非信號肽的臨界值，推測該蛋白無信號肽，無跨膜區域，為非跨膜蛋白；亞細胞定位分析表明，該蛋白主要分布在細胞質和液泡內。功能區域預測結果顯示，從N端到C端由24～52、60～88、97～125、133～161位的氨基酸形成4個保守的結構域，為鈣離子的結合區域。

2.2.3 鹽藻鈣調素的空間結構的預測

鹽藻鈣調素的二級結構預測結果顯示，由93個氨基酸殘基組成的α-螺旋，占整個二級結構的56.71%；由43個氨基酸殘基組成的無規則卷曲，占二級結構的26.22%；β-轉角和伸展片段均由14個氨基酸殘基組成，在二級結構中所占比例為8.54%。利用SWISS-MODEL軟件構建三級結構模型(圖3)，該蛋白外形似啞鈴狀，中間1個螺旋結構連接2個球狀末端，每個末端有2個EF-hand結構域，具有典型的鈣調素的結構特征。

圖3 鹽藻鈣調素的三級結構Fig.3 Three-dimensional constitution of the DsCaM

2.2.4 鹽藻鈣調素的生物進化分析

利用美國國立生物技術信息中心數據庫中的BLAST軟件將該蛋白氨基酸序列與GenBank中的氨基酸序列進行比對及相似性搜索，獲得相似度80%以上的18個物種的序列,用ClustalW 4軟件進行鈣調素氨基酸的多重比對，進化樹采用MEGA 7軟件的鄰接歸并法構建，自展檢驗重復1000次。結果顯示，鹽藻鈣調素與萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii，XP_001703420.1)鈣調素親緣關系最近(圖4)，序列相似度為89%。

2.3 鹽脅迫條件下鹽藻鈣調素基因的表達分析

利用qRT-PCR技術，以18 S rRNA為內參基因,分析鹽脅迫不同時間鹽藻鈣調素基因的表達水平。qRT-PCR結果顯示，在鹽脅迫5 min時，鹽藻鈣調素的表達量就出現顯著性上調變化(P<0.01)，鹽脅迫6 h時其表達量達到最高值，為正常生長條件(1 mol/L NaCl)的9倍(圖5)。隨著脅迫時間的延長其表達量有所下降，但仍高于正常水平。說明鹽藻鈣調素為鹽脅迫快速上調基因，與鹽藻耐受高鹽的分子機制有密切關系。

3 討 論

3.1 鹽藻鈣調素的克隆與生物信息學分析

通過對鹽藻鈣調素基因進行生物信息學分析，明確了其為親水性穩定蛋白，無信號肽，無跨膜區域，為非跨膜蛋白，主要分布在細胞質和液泡內。

圖5 鹽藻鈣調素基因在鹽脅迫不同時間下的表達分析Fig.5 Real-time RT-PCR analysis of the relative expression of the DsCaM gene during various periods of NaCl stress *.P<0.01.

蛋白質的二級結構以α-螺旋(56.71%)和無規則卷曲(26.22%)為主，三級結構同源建模成功，并明確了鹽藻鈣調素的功能域，具有典型的鈣調素的結構特征，該蛋白外形似啞鈴狀，中間1個螺旋結構連接2個球狀末端，每個末端有2個EF-hand結構域，為與鈣離子的結合區域。

鹽藻鈣調素氨基酸數量為164，通過氨基酸序列比對發現，與氨基酸數為149的擬南芥和水稻在13～161位氨基酸同源；與氨基酸數為150的果蠅蛋白序列在14～161位，氨基酸數為163的衣藻蛋白序列在10～156位高度同源。說明鹽藻鈣調素N端蛋白序列是高度可變，這可能與基因表達調控有關，后續的工作將進一步明確其功能。系統進化分析表明，鹽藻鈣調素與萊茵衣藻鈣調素親緣關系最近，序列相似度為89%，這符合物種之間的親緣關系。

3.2 鹽藻鈣調素基因的表達分析

鈣調素是真核細胞內廣泛存在、高度保守的一類最重要的鈣離子受體蛋白[21]。鈣及鈣調素信號途徑在調節生物體的基因表達、細胞分裂、分化等生命活動起到重要的作用[22-24]。為了探討鈣調素基因在鹽藻應答鹽脅迫信號中的作用，筆者采用qRT-PCR技術對鹽藻鈣調素基因在高鹽脅迫下的表達情況進行了分析，該基因在受鹽脅迫的過程中被誘導表達，在鹽脅迫5 min時，鹽藻鈣調素基因的表達量就出現顯著性上調變化，鹽脅迫6 h時其表達量升高到對照組的9倍，這與大多數植物中鈣調素基因的脅迫應答反應相似。表明鹽藻鈣調素基因為鹽脅迫快速上調基因，可能在鹽藻應答高鹽脅迫的生理過程中起到重要作用。后續的工作將采用RNA干擾和免疫共沉淀技術進一步鑒定該基因的功能和篩選與其互作的蛋白質，構建分子調控網絡。

4 結 論

本研究首次從鹽藻中成功克隆了鈣調素基因(GenBank 登錄號為MN428415)。鹽藻鈣調素為親水蛋白，無跨膜區域，不存在信號肽，主要分布在細胞質和液泡內，蛋白質的二級結構以α-螺旋(56.71%)和無規則卷曲(26.22%)為主，具有典型的鈣調素的結構特征，鹽藻鈣調素與萊茵衣藻鈣調素親緣關系最近。鹽藻鈣調素為鹽脅迫快速應答基因，與鹽藻適應高鹽環境有密切關系。