黑麥草對幾種Cd污染鈍化劑的生物學(xué)響應(yīng)研究

燕傲蕾，孫玉喜，田 宇，張 婷，陸景磊

(亳州學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800)

土壤是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，目前我國現(xiàn)有耕地近20%已遭受重金屬污染[1]，生態(tài)環(huán)境部發(fā)布的《2019中國生態(tài)環(huán)境狀況公報》明確指出“影響農(nóng)用地土壤環(huán)境質(zhì)量的主要污染物是重金屬污染，其中鎘為首要污染物”。鎘(Cd)生物毒性高、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，容易通過食物鏈進(jìn)入人體，近年來，貴州赫章、湖南衡東、江西贛州多地均發(fā)生農(nóng)作物重金屬鎘超標(biāo)事件，土壤Cd污染問題已對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。目前治理土壤重金屬污染的思路之一是原位鈍化技術(shù)，即通過向土壤中添加一些可吸附重金屬的材料，降低重金屬元素在土壤環(huán)境中的遷移性及其生物可利用性，最終減少植物對重金屬的吸收和累積[2]。重金屬鈍化修復(fù)操作簡單、不影響作物生產(chǎn)、適合大面積推廣，是土壤重金屬污染修復(fù)最有效的方法之一[3]。

目前，曾卉、計海洋等研究者在土壤鈍化材料的篩選、鈍化劑對重金屬的吸附特征等方面均進(jìn)行了一定的研究[4-6]，筆者也從不同類別的鈍化劑中選擇了秸稈炭、腐殖酸、硅酸鈣和蛭石四種鈍化劑，通過裸土實驗研究了不同鈍化劑對亳州地區(qū)土壤性質(zhì)和養(yǎng)分狀況的影響。但是，鈍化劑對重金屬污染土壤的實際修復(fù)效果，檢驗的最終標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該體現(xiàn)在植物指標(biāo)上，陳望舒、Zama等也提出應(yīng)加強(qiáng)鈍化材料對植物生長生理等生物學(xué)實際效果的研究[7-9]。黑麥草(LoliumperenneL.)生長迅速，易于播種，對重金屬耐性較強(qiáng)，在環(huán)境治理中具有指導(dǎo)意義[10]。因此，本文通過黑麥草盆栽實驗，系統(tǒng)的研究在亳州Cd污染土壤基質(zhì)中，添加四種鈍化劑對黑麥草生長、生理指標(biāo)的影響，以生物指標(biāo)評價四種鈍化劑對亳州地區(qū)土壤Cd污染的鈍化效果，為亳州地區(qū)Cd污染的鈍化修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

供試土壤為安徽省亳州市近郊某藥材種植基地0～20 cm深度的耕作層土壤，土壤基本性質(zhì)為pH 7.70，有機(jī)質(zhì)含量12.26 g/kg，全氮1.20 g/kg，硝態(tài)氮0.031 g/kg，有效磷0.014 g/kg，速效鉀 0.179 g/kg。

實驗所用秸稈炭(AC)由南京智融聯(lián)科技有限公司提供，由小麥秸稈在400 ℃條件下限氧裂解獲得(專利號：200920232191.9)，腐殖酸(HA)、硅酸鈣、蛭石均購自合肥博美藥品有限公司。

供試植物1年生黑麥草(LoliumperenneL.)種子由艾通園林有限公司提供。

主要儀器設(shè)備：紫外可見分光光度計(上海元析 UV6100)；電導(dǎo)率儀(梅特勒 S230-USP/EP)。

1.2 實驗設(shè)計

土壤采集后自然風(fēng)干、除雜，過10目尼龍篩，稱取500 g置于花盆中，以溶液形式添加CdCl2使土壤Cd含量(以風(fēng)干土中的Cd2+計)為5 mg/kg，混合均勻后老化備用。土壤老化15 d后，在四個實驗組中分別添加秸稈炭、腐殖酸、硅酸鈣、蛭石，每種鈍化劑均設(shè)置1%、3%、5%三個添加濃度，另設(shè)不添加鈍化劑的Cd污染土壤一組作為空白對照，以上每種處理均設(shè)3組重復(fù)，土壤穩(wěn)定15 d備用。

土壤準(zhǔn)備完成后，挑選大小均勻、顆粒飽滿的黑麥草種子，每盆播種50粒，待種子出苗后繼續(xù)培養(yǎng)30 d，培養(yǎng)期間通過重量法保持60%～70%的田間含水量。培養(yǎng)結(jié)束后，將黑麥草小心連根取出，自來水沖洗干凈后用濾紙吸干備測。

1.3 樣品分析

每盆隨機(jī)抽取15株黑麥草，用刻度尺進(jìn)行黑麥草根部和地上部分的長度測定，計算耐性指數(shù)。

葉片電導(dǎo)率(EL)的測定：將葉片剪成長約1 cm小段置于三角瓶中，按1∶10的比例加雙蒸水，以400次/min的速度振蕩1 h后，用電導(dǎo)儀測定溶液電導(dǎo)率。

膜脂過氧化物丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法進(jìn)行測定[11]：取0.5 g鮮葉，加 5 mL5%TCA進(jìn)行研磨，所得勻漿3000 r/min離心10 min后取上清液2 mL，加 0.67%TBA 2 mL，混勻后沸水浴30 min，冷卻后再離心一次，取上清液在450 nm、532 nm、600 nm下測定其吸光度。

葉綠素含量參照李合生的方法[12](P134-P137)：取0.2 g鮮葉剪碎，加少量石英砂、碳酸鈣粉和2～3 mL80%丙酮研成勻漿，再加80%丙酮10 mL研磨至組織變白。靜置5 min后過濾至25 mL棕色容量瓶定容。以80%丙酮為空白在665 nm、649 nm和470 nm下測定葉片葉綠素提取液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

耐性指數(shù)(Tolerance Index)= 實驗組根系平均長度/對照組根系平均長度變化率(Rn)=(Xn-X0)/X0×100%。其中，X0為空白組指標(biāo)數(shù)值，Xn為各實驗組土壤對應(yīng)指標(biāo)數(shù)值。

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差并進(jìn)行差異顯著性分析(LSD法)和相關(guān)分析，采用Origin 8.0 進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種鈍化劑對黑麥草生長指標(biāo)的影響

莖葉長和根長能直觀反應(yīng)黑麥草的生長狀況。從表1可以看出：秸稈炭組莖葉長和根長均值均高于空白組，耐性指數(shù)均高于1，且長度指標(biāo)和耐性指數(shù)隨秸稈炭添加濃度的上升表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在3%添加量下達(dá)到最大值，莖葉長和根長分別比空白高17.70%和21.12%，與空白組存在顯著差別(P<0.05)；腐殖酸組、蛭石組和硅酸鈣組長度指標(biāo)和耐性指數(shù)則隨著鈍化劑添加濃度的上升而下降，在1%添加量下，腐殖酸組莖葉長和根長分別比空白高12.47%和16.11%，與空白組差異明顯(P<0.05)，蛭石組莖葉長和根長均值也略高于空白，但差異未達(dá)到顯著程度(P>0.05)，硅酸鈣組莖葉長和根長均值普遍低于空白組，當(dāng)硅酸鈣添加量達(dá)到3%時，莖葉長和根長均顯著低于空白組(P<0.05)，在5%硅酸鈣組中，莖葉長和根長比空白組降低了13.08%和19.88%，耐性指數(shù)達(dá)到最低值0.80。對比同一添加濃度下不同鈍化劑對黑麥草的影響，在1%添加濃度下，黑麥草長度指標(biāo)和耐性指數(shù)為腐殖酸組>秸稈炭組>蛭石組>硅酸鈣組，但組間差異不顯著(P>0.05)，在3%和5%添加量下黑麥草長度指標(biāo)和耐性指數(shù)為秸稈炭組>腐殖酸組>蛭石組>硅酸鈣組，3%組中，秸稈炭組長度指標(biāo)顯著高于其他組，5%組中，硅酸鈣組長度指標(biāo)顯著低于秸稈炭和蛭石組(P<0.05)。

表1 四種鈍化劑對黑麥草生長指標(biāo)的影響

2.2 四種鈍化劑對黑麥草生理指標(biāo)的影響

2.2.1 四種鈍化劑對黑麥草葉片電導(dǎo)率的影響

植物在逆境脅迫下，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)滲出，電導(dǎo)率升高。因此，電導(dǎo)率可用于判斷細(xì)胞膜受害的程度，是衡量植物抗性的重要指標(biāo)，在植物抗逆性研究中應(yīng)用十分廣泛[13-14]。從圖1可以看出，在1%濃度下，電導(dǎo)率表現(xiàn)為腐殖酸組<秸稈炭組<蛭石組<硅酸鈣組，但組間差異不顯著(P>0.05)，且各鈍化劑組電導(dǎo)率均低于空白組。隨著鈍化劑添加量的提高，秸稈炭組葉片電導(dǎo)率先下降后上升，電導(dǎo)率變化率在3%濃度下達(dá)到最小值-9.18%；腐殖酸組、蛭石組和硅酸鈣組的電導(dǎo)率則表現(xiàn)出上升趨勢，在3%和5%濃度下，電導(dǎo)率均為秸稈炭組<蛭石組<腐殖酸組<硅酸鈣組，硅酸鈣組電導(dǎo)率水平顯著高于秸稈炭組(P<0.05)。

圖1 四種鈍化劑對黑麥草電導(dǎo)率變化率的影響

2.2.2 四種鈍化劑對黑麥草葉片MDA含量的影響

膜脂過氧化水平反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧的累積程度，影響植物細(xì)胞代謝狀況[15]，MDA作為膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量能反應(yīng)細(xì)胞膜的損傷程度，是衡量細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)[16]。比較不同鈍化劑對黑麥草葉片MDA含量的影響(圖2)可以看出：MDA含量在1%濃度下為秸稈炭組<腐殖酸組<蛭石組<硅酸鈣組，在3%和5%濃度下為秸稈炭組<蛭石組<腐殖酸組<硅酸鈣組。添加活性炭降低了黑麥草葉片細(xì)胞中MDA的含量，且降幅在3%秸稈炭組最大，達(dá)到20.95%，3%秸稈炭組的MDA水平顯著低于同濃度的其他鈍化劑組(P<0.05)；腐殖酸和蛭石組MDA含量僅1%濃度下略低于空白，硅酸鈣組MDA含量則在各濃度下均高于空白組，且腐殖酸、硅酸鈣和蛭石組MDA含量均隨著添加濃度的上升而上升，在5%濃度下，腐殖酸、硅酸鈣和蛭石組MDA增幅分別達(dá)到15.08%、29.54%和10.75%，MDA水平顯著高于秸稈炭組(P<0.05)。

圖2 四種鈍化劑對黑麥草MDA變化率的影響

2.2.3 四種鈍化劑對黑麥草葉綠素含量的影響

葉綠素是植物光合作用的重要物質(zhì)，是植物實現(xiàn)無機(jī)物到有機(jī)物轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，對植物自身和整個生態(tài)系統(tǒng)都具有重要意義。從黑麥草葉片葉綠素在四組鈍化劑處理中的變化情況(圖3)可以看出：在1%添加濃度下，葉綠素含量為腐殖酸組>秸稈炭組>蛭石組>硅酸鈣組，但組間差異不顯著(P<0.05)，且各鈍化劑組葉綠素含量均高于空白組。除秸稈炭組葉綠素含量隨鈍化劑添加量先上升后下降，在3%濃度時葉綠素升高19.57%外，腐殖酸組、蛭石組和硅酸鈣組葉綠素含量均隨鈍化劑濃度的上升而下降，在3%和5%濃度下，葉綠素含量分別為秸稈炭組>腐殖酸組>蛭石組>硅酸鈣組和秸稈炭組>蛭石組>腐殖酸組>硅酸鈣組，秸稈炭組葉綠素含量顯著高于硅酸鈣組(P<0.05)。

圖3 四種鈍化劑對黑麥草葉綠素變化率的影響

2.3 黑麥草生長、生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

在Cd脅迫下，植物往往表現(xiàn)出細(xì)胞膜過氧化水平升高，細(xì)胞膜透性增加，電導(dǎo)率上升，光合色素含量下降等現(xiàn)象，植物對Fe、Mn等礦質(zhì)元素的吸收利用情況也發(fā)生變化，從而影響植物的生長和生物量的累積[17]。目前，表征植株對重金屬的耐性往往采用耐性指數(shù)，常通過計算實驗組與空白組根長之比來表示[18]，但是，黑麥草根系較為細(xì)弱，在種植過程中不同植株之間根系互相交錯，在取材時容易斷裂，獲得準(zhǔn)確數(shù)值較地上部分難度更高。通過黑麥草在四種鈍化劑環(huán)境下的莖葉長、根長、電導(dǎo)率、MDA含量、葉綠素含量的相關(guān)性分析(表2)可以看出：黑麥草根長和莖葉長、葉綠素含量三者極顯著正相關(guān)(P<0.01)，根長、莖葉長、葉綠素含量與MDA含量、電導(dǎo)率極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，且電導(dǎo)率負(fù)相關(guān)程度最高。良好的土壤鈍化劑可以通過降低土壤重金屬可利用部分降低電導(dǎo)率水平和MDA含量，提高葉綠素的含量，從而促進(jìn)植株地上、地下部分的生長。因此，采用黑麥草進(jìn)行土壤Cd污染鈍化修復(fù)研究時，可以直接以地上部分生長狀況表征植株耐性，李希銘等的研究中也發(fā)現(xiàn)草坪草地上部分較根系對Cd等重金屬更敏感[19]，因此以黑麥草地上部分指標(biāo)表征其耐受性更簡單靈敏。在植株材料有限的情況下，可選擇電導(dǎo)率或葉綠素含量來代表黑麥草的生理狀況，作為鈍化劑對重金屬污染修復(fù)的首選生物學(xué)指標(biāo)。

表2 黑麥草生長指標(biāo)、生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

通過黑麥草盆栽實驗，我們發(fā)現(xiàn)秸稈炭在1%～5%各添加濃度均能降低黑麥草葉片電導(dǎo)率、MDA含量，提高葉片葉綠素含量，促進(jìn)黑麥草莖葉、根系的伸長，提高黑麥草的耐性指數(shù)，且以3%秸稈炭添加量最佳，MDA含量和莖葉長、根長與同濃度其他鈍化劑組存在顯著差異；腐殖酸在1%添加量下電導(dǎo)率、MDA含量、葉綠素含量和黑麥草生長指標(biāo)優(yōu)于秸稈炭，但當(dāng)添加量上升到3%后，腐殖酸組黑麥草葉片電導(dǎo)率和MDA含量快速上升，葉綠素含量、莖葉長和根長持續(xù)下降；蛭石在1%～3%濃度間，對黑麥草的生長指標(biāo)和生理指標(biāo)表現(xiàn)出有利影響，在5%濃度下，對黑麥草生長、生理指標(biāo)表現(xiàn)出不利影響，但影響程度與其他鈍化劑相比較小；硅酸鈣僅在1%濃度下使黑麥草電導(dǎo)率降低、葉綠素升高，隨著添加量上升，電導(dǎo)率和MDA含量上升，長度指標(biāo)、耐性指數(shù)和葉綠素含量持續(xù)下降，對黑麥草的生長表現(xiàn)出不利影響。

從黑麥草生物響應(yīng)情況來看，在秸稈炭、腐殖酸、硅酸鈣、蛭石四種鈍化劑中，秸稈炭在所用亳州地區(qū)土壤中表現(xiàn)出良好的Cd鈍化修復(fù)能力，結(jié)合成本考慮，以添加量在1%～3%為宜；腐殖酸也有Cd鈍化修復(fù)的能力，但需要控制在1%左右的低濃度范圍，蛭石在Cd鈍化修復(fù)中作用不夠突出，變化幅度小，可以考慮將腐殖酸和蛭石可以作為復(fù)合鈍化劑的組分進(jìn)行鈍化劑的優(yōu)化；硅酸鈣在本實驗中整體表現(xiàn)不利于黑麥草生長的情況，不適合作為亳州地區(qū)土壤的Cd污染鈍化修復(fù)劑。莖葉長、電導(dǎo)率和葉綠素含量均可以作為黑麥草在土壤Cd污染鈍化修復(fù)效果研究中的首選生物學(xué)指標(biāo)。