多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢組織BMP-15及子宮內膜Glycodelin-A的表達*

李云秀 官潔 馬蕊 徐永芳 鐘蘭萍 俞健梅

(云南省第一人民醫院·昆明理工大學附屬醫院生殖醫學科，云南 昆明 650032)

多囊卵巢綜合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是育齡婦女中最常見的內分泌紊亂疾病，主要表現為稀發排卵或無排卵和高雄激素血癥，是無排卵性不孕的主要原因，而懷孕后流產率高達20%～50%，是正常女性的3～10倍[1]。研究認為與PCOS卵子質量、代謝異常和子宮內膜容受性下降有關[2-3]。本研究擬通過檢測PCOS大鼠卵巢組織骨形態發生蛋白-15(bone morphogenic proteins 15，BMP-15)以及子宮內膜表達的糖蛋白因子Glycodelin-A(GdA)，分析PCOS卵泡發育異常及子宮內膜容受性下降的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選擇21日齡SD雌性大鼠(21日齡大鼠斷乳，進入性發育期，至42日齡性發育成熟)共75只，體質量(53.8±9.2)g，購自南京東極生物科技，飼養于昆明醫科大學動物實驗室，清潔級飼養，環境溫度20～23 ℃，濕度40%～60%，每日光照12 h，自由飲水，喂以標準大鼠顆粒飼料。

1.2 主要試劑、儀器 脫氫表雄酮(DHEA)針劑(上海麥克林生化科技公司)，全自動生化分析儀器(美國Beckman Coulter公司)，BMP-15及FSHR抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(美國Abcam公司),孕馬血清(PMSG)(赤峰博恩藥業)，Gd-A和LIF 酶聯免疫(ELISA)試劑盒(上海雙贏生物科技公司)，Gd-A和LIF抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(美國Abcam公司)。

1.3 分組及PCOS大鼠模型構建 SD大鼠適應性喂養2 d后于23日齡開始造模，隨機分為正常對照組(對照組)25只和PCOS模型組(PCOS組)(50只，按照標準化動物實驗最低動物例數，每組不少于25例，考慮有PCOS大鼠建模失敗可能，故PCOS組大鼠為對照組大鼠數量2倍)。兩組大鼠體重、空腹血糖(FBG)、血清雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕激素(P)，促卵泡生長激素(FSH)、促黃體生成素(LH)及空腹胰島素(FINs)無明顯差異(表1)。對照組大鼠每日頸背部皮下注射0.2 mL注射油劑；PCOS組大鼠每日頸背部皮下注射DHEA6 mg/100 g體重+0.2 mL注射油劑共21天。兩組大鼠在用藥后10 d，每天陰道涂片，觀察動情周期變化，共觀察10 d，當模型組大鼠無規律動情周期出現，陰道脫落細胞呈持續動情間期表現，PCOS大鼠模型構建成功。

1.4 方法

1.4.1 激素和血糖測定 兩組大鼠在注藥的第20天(42日齡)晚8 時開始禁食，于注藥的第21日晨稱重,獲取鼠尾血清2～3 mL，離心后采用全自動生化分析儀測定大鼠血清FSH、 LH、E2、P、T、FBG、FINs濃度。

1.4.2 卵巢組織HE染色及免疫組化染色 PCOS組10只，對照組5只于注藥后21天處死獲取雙側卵巢稱重，觀察卵巢大體解剖情況，并測量雙側卵巢的長/寬/高，根據橢圓形體積公式計算卵巢的體積(mL)=0.5×長(cm)×寬(cm)×高(cm)，文中提及的卵巢體積和卵巢重量均為左、右卵巢之和。用刀片經卵巢中軸切下部分卵巢組織用中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，制成2 um厚的切片，按照常規HE染色制片，光鏡下觀察卵巢組織形態學改變。采用BMP-15及FSHR抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒進行免疫化染色，操作方法按試劑盒說明。陽性染色為棕黃色，每個組織點隨機選取3個完整而不重疊的高倍鏡視野(400×)，應用Image pro plus 6.0圖像分析軟件，測定每個視野下陽性反應的積分光密度(Integrated Optical Density，IOD)，以每例3個視野的積分光密度平均值作為該組織點的IOD測量值。

表1 兩組大鼠基礎情況比較

1.4.3 子宮內膜容受性觀察 將余下的PCOS組大鼠40只，對照組大鼠20只繼續飼養,觀察每天陰道脫落細胞是否有動情周期恢復，觀察兩周后誘導排卵：注射20 IU孕馬血清(PMSG)，48 h后注射HCG20 IU，當日雌雄大鼠，按2∶1和籠。次日檢查有陰道栓者認為受孕，為受孕第一天。分別于受孕第3、5、7、9日，分四批處死大鼠獲取子宮，用2 mL生理鹽水沖洗宮腔獲得沖洗液，以3000 rpm離心10 min，獲取上清液，收集于1.5 mL EP 管中，保存于-20 ℃冰箱，ELISA方法測定沖洗液中Gd-A和LIF的濃度。剖開宮腔，獲取無胚胎附著的子宮內膜組織用中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，制成2 μm厚的切片，進行免疫組化染色，采用Gd-A和LIF抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒進行免疫化染色。同法測定Gd-A和LIF在子宮內膜不同時期陽性表達的IOD值。

2 結果

2.1 兩組一般情況、血清性激素水平及胰島素抵抗的評估比較 注藥21天后PCOS組和對照組大鼠均發育良好，體毛潤澤，攝食及行為無明顯差異，反應靈活，PCOS大鼠體重(82.97±14.54)g顯著小于對照組(115.08±17.05)g，差異有統計學意義(P<0.05)。PCOS組大鼠血清FSH、LH、P、T、FBG、FINS水平均高于對照組(P<0.05)，E2低于對照組(P<0.05)。PCOS組大鼠存在胰島素抵抗和高雄血癥。見表2。

表2 兩組激素水平比較

2.2 兩組卵巢組織學改變比較 PCOS組大鼠的卵巢表面蒼白，隱約可見包膜下擴張的卵泡，對照組大鼠的卵巢表面色澤紅潤，飽滿。PCOS組大鼠卵巢體積(0.05±0.004) mL及重量(50.97±17.29) mg均低于對照組[(0.066±0.006) mL，(69.89±19.21) mg]，差異有統計學意義(P<0.01)。HE染色光鏡下見PCOS組大鼠卵巢皮質內各級發育期卵泡及黃體少見，卵泡多呈囊性擴張，卵泡內卵母細胞或放射冠消失，顆粒細胞層數減少(多為2～3層)，排列疏松；卵泡膜細胞、間質細胞增生。對照組大鼠卵巢鏡下見發育各個時期的卵泡和黃體；顆粒細胞形態完整，排列整齊，多為8～9層，卵泡膜細胞、間質細胞未見增生。見圖1。

圖1 PCOS組和對照組卵巢HE染色

2.3 兩組卵巢BMP-15和FSHR表達比較 PCOS組大鼠的卵巢BMP-15和FSHR光鏡下觀察陽性表達明顯弱于對照組(圖2)。BMP-15和FSHR陽性反應IOD測量值PCOS組(980.91±65.51；1070.12±54.18)明顯低于正常對照組(4919.72±460.13；5743.66±311.19)，差異均有統計學意義(P<0.01)。

圖2 PCOS組和對照組卵巢BMP-15和FSHR免疫組化染色

2.4 兩組子宮內膜容受性改變比較 PCOS組大鼠飼養兩周，陰道脫落細胞觀察未出現動情周期，而對照組大鼠的動情周期為(5.1±1.4)d。給予孕馬血清誘導排卵，在受孕后不同時間順序觀察Gd-A和LIF在子宮腔內沖洗液濃度變化及在子宮內膜的表達。在光鏡下觀察子宮內膜免疫組化染色情況，可見隨時間的增加，對照組子宮內膜逐漸變厚，腺體增生擴張明顯，細胞增大，其內分泌空泡明顯增多，同時Gd-A和LIF陽性染色細胞數也是逐漸增加(圖3)，IOD值測定兩者呈同步上升趨勢。而PCOS組子宮內膜增生不明顯，腺體增生不明顯，分泌空泡少見，同時Gd-A和LIF陽性染色細胞數較少，隨時間推移陽性細胞增加不明顯(圖4)，IOD值未見明顯改變，與同期對照組比較有顯著性差異(P<0.05)(表3)。宮腔沖洗液Gd-A和LIF濃度變化也是類似結果，見表4。

3 討論

PCOS是育齡婦女中最常見的內分泌紊亂疾病，主要表現為稀發排卵或無排卵和高雄激素血癥，同時集合了一組多樣的多系統的慢性內分泌紊亂，包括胰島素抵抗(RI)，糖代謝異常、脂代謝異常等[4]。高雄激素在PCOS的發病及內分泌紊亂中起到至關重要的作用[5]。本研究采用雄激素誘導成功構建了PCOS大鼠模型，大鼠卵泡出現多囊樣改變，各級發育卵泡及黃體少見同時伴激素異常及胰島素抵抗。PCOS的卵泡發育異常表現為大量卵泡發育至5 mm時停滯，竇卵泡數是卵巢功能正常者的2～3倍[6]，PCOS存在卵泡成熟障礙，但機制并不完全清楚。隨著BMP-15、生長分化因子-9(GDF-9)等卵母細胞源性生長因子的發現及對其功能的深入研究，卵母細胞自分泌及調控在卵泡成熟中的關鍵作用越加受重視，認為PCOS卵泡發育障礙與之密切相關[7]。BMP-15是TGF-β超家族的主要成員之一，目前的研究表明其僅存在于哺乳動物的卵巢中，由卵母細胞表達合成。在人類始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡以及成熟卵泡的發育過程中均有表達，在整個卵泡發育過程中都有重要作用[8]，是促卵母細胞生長、抑制顆粒細胞凋亡的重要因子[9-10]。同時認為其為黃體化抑制劑，避免卵母細胞過早排出機體，核質成熟不同步，對卵子的成熟及優質卵子的形成有重要作用[11-13]，魏莉娜等[14]發現BMP-15蛋白在PCOS卵泡發育的早期階段表達水平降低、滯后。動物實驗發現BMP-15雜合突變的羊卵泡發育停滯在初級卵泡階段，而穩定濃度(200 ng/mL)的重組BMP-15蛋白可以促進竇前卵泡、竇卵泡發育[15]。本研究顯示，PCOS模型大鼠卵巢BMP-15表達明顯低于正常，同時FSHR也低于正常，由此推測，PCOS患者卵巢局部BMP-15表達下降，抑制了原始卵泡的啟動和初級卵泡的發育，同時對FSH的反應性減低，進一步影響了PCOS卵泡的發育成熟。研究發現PCOS患者卵母細胞BMP-15合成異?？梢砸l凋亡相關因子 BAX、BCL-2 異常表達增加卵丘細胞凋亡率[16]。并且原發性卵巢功能不全(POI)也與BMP-15表達下降有關[8]。因此BMP-15表達異常在不同疾病中可能存在不同的調節機制，所以BMP-15對卵泡發育調節機制值得進一步研究。

圖3 不同時間兩組子宮內膜LIF的表達

圖4 不同時間兩組子宮內膜Gd-A的表達

表3 兩組不同時間子宮內膜LIF和Gd-A的表達

表4 兩組不同時間子宮腔沖洗液LIF和Gd-A的比較

影響子宮內膜容受性的研究中，很多種因子參與了子宮內膜容受的調控。眾所周知的有雌孕激素以及其在子宮內膜的受體、白血病抑制因子(LIF)，整合素,妊娠相關蛋白Glycodelin[17]。Glycodelin 是一類具有再生能力的組織中及一些腫瘤組織合成的糖蛋白，子宮內膜合成的Glycodelin因其最初是在羊水(amniotic fluid)中發現而被稱為Glycodelin- Amniotic (Gd-A)。Gd-A 是由分泌期和蛻膜樣子宮內膜腺體的上皮細胞合成，大部分分泌到子宮腔內，小部分釋放到周圍循環中。在有規律月經周期,Gd-A通常于排卵后的4～5 d或出現促黃體生成素，峰值后5～6 d((此時正為胚胎種植窗))出現在一些子宮內膜腺體中,宮腔沖洗液和血清中可以檢測到Gd-A,至排卵后10 d即分泌晚期所有的子宮內膜腺體均有表達,Gd-A分泌達到峰值,血Gd-A濃度超過基礎值300倍以上,此時子宮沖洗液中Gd-A濃度是血清濃度的100倍左右。峰值持續到下次月經來潮的第一天,然后迅速下降,至月經第7天降到基礎狀態，而一旦妊娠胚胎著床后其合成迅速增加[18-19]。近年來研究表明， Gd-A是一種免疫抑制性蛋白，它能抑制自然殺傷免疫細胞( NK) 的免疫活性并減低Th1/Th2比值[20-22]，說明其在胚泡的成功植入及正常妊娠的維持有重要意義。因此根據Gd-A在子宮內膜的規律性表達，黃體中晚期子宮沖洗液Gd-A的濃度可以作為一種評價子宮內膜功能的無創性檢查方法。LIF已被證明是胚胎著床的必要因子, 且與植入時間緊密相連, 在胚胎著床中起重要調節作用, 是著床窗口開放所必需的細胞因子[23]。因此本研究將Gd-A納入評價PCOS子宮內膜容受性的研究指標并與LIF做對比，客觀分析Gd-A在評價子宮內膜容受性中的意義。本研究結果提示，在正常大鼠中，隨著孕期增加Gd-A與LIF同步增加，相比之下PCOS模型大鼠子宮內膜Gd-A和LIF隨孕期延長并未見明顯增加，說明PCOS在內分泌紊亂的狀態下，子宮內膜的容受性受到影響，導致PCOS妊娠率下降并且流產率增加。對于PCOS或不孕患者子宮內膜容受性無創性的評估主要有B超下內膜的厚度及相關血流動力學參數評估，血清雌孕激素測定，可以間接反映子宮內膜容受性[24-26]。本研究采用宮腔沖洗液測定Gd-A和LIF濃度評估子宮內膜容受性，發現Gd-A和LIF同步增加，并與子宮內膜腺體表達有一致性，相比之下宮腔沖洗液Gd-A濃度明顯高于同期LIF濃度，變化幅度更加明顯，更有利于比較觀察，因此采用宮腔沖洗液Gd-A可以作為評價子宮內膜容受性的無創性檢查并可以動態觀察，了解內膜內分泌狀態，具有較高臨床應用前景。然而我們還需要進行大樣本的臨床研究確定子宮腔沖洗液Gd-A濃度的界值，使其具有實際臨床應用價值。

4 結論

PCOS卵母細胞BMP-15表達異?？赡苁荘COS卵泡發育障礙的原因之一，卵巢局部微環境的調節失衡是 PCOS 患者卵泡發育異常的重要因素。同時PCOS大鼠子宮內膜的容受性指標Gd-A和LIF均低于正常，提示PCOS低妊娠率和高流產率與子宮內膜容受性密切相關。