鏈脲佐菌素誘導2型糖尿病大鼠年齡和劑量的相關性*

曾順 熊悅 買文菊 雷關芝 佘光鵬 劉華 買文麗

(1.川北醫學院2014級臨床本科，四川 南充 637000；2.川北醫學院2016級臨床本科，四川 南充 637000；3.西昌市南寧中心衛生院，四川 西昌 615000；4.川北醫學院2017級麻醉本科，四川 南充 637000；5.川北醫學院生理教研室，四川 南充 637000；6.川北醫學院機能中心，四川 南充 637000)

國際糖尿病聯盟公布，到2017年全球糖尿病患者已達到4.25億，我國糖尿病患者高達1.14億，為全球之首[1-2]。因此，理想糖尿病動物模型的建立對于疾病的研究意義重大。目前常用高糖高脂飲食配合注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立糖尿病動物模型[3-4]，該模型具備操作簡單、成模周期短、比基因鼠價格更低等優點，但該方法不足之處是實驗動物狀態和藥物劑量會對成模動物肝腎功能和凝血系統造成嚴重影響，從而降低模型動物的生存率[5]。本實驗通過對年齡和藥物劑量間的相關性進行研究，探討最佳造模方式，為糖尿病大鼠高效造模提供可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級4周齡雄性健康SD大鼠100只，由川北醫學院實驗動物中心提供，體質量(120±20) g。動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。動物合格證號SYXK(川)2018-0761。

1.1.2 藥品與試劑 鏈脲佐菌素(solarbio公司，批號：615F031)；血糖試紙(三諾有限公司，批號：3825NS)。天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、堿性磷酸酶(AKP)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)，以上檢測試劑盒批號均為20180710，均購自南京建成生物研究所。

1.1.3 儀器 三諾血糖儀，MB-530酶標儀(匯松科創有限公司)，離心機，低溫冰箱

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型的建立 動物隨機分為飼養4周對照組、4周低劑量組、4周高劑量組、8周對照組、8周低劑量組、8周高劑量組。4周和8周對照組大鼠分別為10只，其余造模組大鼠每組各20只。模型組給予高脂高糖飼料(D12492購自Research Diets公司)喂養4周和8周后造模。檸檬酸2.1 g加入雙蒸水100 mL中配成A液。檸檬酸鈉2.94 g加入雙蒸水100 mL配成B液，將A、B液按1∶1比例混合調節pH 4.2～4.5的檸檬酸緩沖液。注射時以0.1%的檸檬酸緩沖液配置注射所需STZ濃度。每個年齡段的STZ分兩個劑量：1%的STZ25 mg/kg和40 mg/kg進行腹腔注射，對照組腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。注射STZ后2 d、6 d鼠尾取血測空腹血糖(FBG)，若2次空腹血糖均≥11.1 mmol/L，認為造模成功。

1.2.2 標本收集與處理 造模后第6天，大鼠稱重，異氟醚吸入麻醉后，內眥取血1 mL，測空腹血糖，剩余血液0～4 ℃靜置1 h，3500 r·min-1離心5 min，取上清液置于-80 ℃以備用，根據試劑盒說明書操作檢測AKP、ALT、AST、CRE、BUN、APTT、PT。

2 結果

2.1 各組動物模型建立結果比較 4周高劑量組造模第6天死亡率高達80%;8周低劑量組造模第6天死亡率0%，成模率85%；8周低劑量組死亡率最低，各組死亡率差異性顯著(P<0.001)；各組成模率差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 造模6天各組大鼠死亡率及成模率比較[n(×10-2)]

2.2 各組大鼠血清AKP、ALT、AST活力變化 與對照組比較，4周造模組和8周高劑量組AKP差異顯著(P<0.05)；模型組間比較，8周低劑量組與其他造模組間存在顯著性差異(P<0.05)。4周和8周造模組ALT和AST均與其對照組有顯著性差異(P<0.05)，8周低劑量組與其他造模組間存在顯著性差異(P<0.05)。見圖1。

圖1 造模后6天各組大鼠血清AKP、ALT、AST值比較

2.3 各組大鼠血清CRE、BUN活力變化 與其對照組比較，4周造模組和8周高劑量組CRE均表現出顯著性差異(P<0.05)；模型組間比較，8周低劑量組CRE與其他造模組間均存在顯著性差異(P<0.05)。4周造模組BUN均與4周對照組有顯著性差異(P<0.05)，8周造模組與8周對照組BUN比較差異均無統計學意義(P>0.05)。8周低劑量組BUN與4周低、高劑量組均有顯著性差異(P<0.05)。見圖2。

圖2 造模后6天各組大鼠血清CRE和BUN值比較

2.4 大鼠血清APTT、PT的變化 4周造模組APTT與其對照組均有顯著性差異(P<0.05)；8周低劑量APTT與其對照組無顯著性差異(P>0.05)，8周高劑量組與其對照組有顯著性差異(P<0.05)；8周低劑量組APTT與其他造模組間存在顯著性差異(P<0.05)。造模組PT雖有升高，但僅4周高劑量組與4周對照組有顯著性差異(P<0.05)。見圖3。

3 討論

近年中國糖尿病患病率急劇增加，已成為全球糖尿病患者人數最多的國家之一[6]。因此對糖尿病的研究尤為迫切，而理想糖尿病模型是研究的前提。目前，糖尿病模型的制備主要有試劑、手術和基因動物。試劑復制模型方法簡單便宜，故目前國內建立動物模型主要方法還是以化學藥物注射誘導為主，其中一次性注射大劑量STZ進行造模，是目前普遍選用的方法[7]。STZ是一種DNA烷基化試劑(氨基葡萄糖-亞硝基脲)，其對胰腺β細胞有高選擇的毒性作用，獨立通過GLUT2葡萄糖轉運蛋白(GLUT2 glucose transport protein)進入胰腺β細胞[8]，破壞β細胞，減少胰島素釋放，故作為復制糖尿病模型常用的試劑[9]。通常單次大劑量注射STZ可引起胰島β細胞的廣泛破壞，造成1型糖尿病模型；而多次小劑量注射STZ聯合高脂喂養，則可導致部分β細胞損傷和外周胰島素抵抗，從而造成2型糖尿病模型。大劑量注射導致胰島β細胞大量死亡，使血糖迅速升高，造模成功率高，但是該方法易造成動物酮癥酸中毒死亡[10-11]。小劑量多次腹腔注射STZ，雖可使血糖水平逐步上升，但造模時間長，模型穩定性差，不利于慢性實驗開展。因此，本研究將實驗動物年齡和一次性注射STZ劑量的相關性進行比較，探討高效穩定的復制2型糖尿病模型的方法。此外，研究顯示雄性動物的糖尿病成模率明顯高于雌性動物[12-13]。故本實驗均選用SD雄性大鼠，保證實驗的一致性，提高成模率。

圖3 造模后6天各組大鼠血清APTT和PT值

血糖結果顯示一次性腹腔注射STZ后4周高、低劑量組和8周高、低劑量組均造模成功，且成模率四組差異無統計學意義，這表明兩個年齡段和兩種劑量均能復制2型糖尿病模型。但4周高劑量組大鼠造模6天存活率僅20%，這樣的成活率完全不能滿足實驗要求。而8周低劑量組大鼠成模率85%，存活率100%，能形成穩定的實驗模型。實驗發現4周高、低劑量組、8周高劑量組有多只大鼠在注射STZ后第2天開始出現眼睛和鼻腔出血，精神萎靡，迅速死亡，這與楊穎等[14]的研究結果相似。對大鼠血液生化進行分析，發現該三組大鼠APTT和PT明顯延長，APK、ALT、AST明顯升高，考慮高劑量組大鼠因藥物劑量過大，肝腎功能損傷嚴重，肝臟合成凝血酶能力下降，出現凝血功能障礙；而4周低劑量組出現相同癥狀考慮雖然低劑量但是大鼠年齡小，因此藥物也對肝腎造成嚴重損傷。同時該三組大鼠注射后，第2天多只大鼠血糖>33.3mmol/L,血酮>5mmol/L，出現酮癥酸中毒，故考慮大鼠死亡與酮癥酸中毒和肝腎嚴重損傷有關。喂養8周高劑量組肝腎損傷均低于喂養4周高劑量組，大鼠存活率也更高，表明相同劑量，年齡越大肝腎損傷越小，存活率越大[14]；4周高低劑量組和8周高低劑量組均顯示出相同年齡，劑量越小，肝腎損傷越小的傾向。

目前STZ造模劑量一般在25～70 mg/kg之間，且需要反復注射[15-16]。管志敏等[17]用STZ 20 mg/kg對8周齡大鼠多次腹腔注射復制模型。徐文平[18]用40、45、50 mg/kg STZ進行腹腔一次性注射造模，發現45 mg/kg組造模效果最好。與以上實驗相比，本實驗用低劑量25 mg/kg一次性注射成功復制2型糖尿病模型，減少對大鼠肝腎損傷，延長大鼠存活時間。本實驗發現鼠齡越大反而造模劑量越小，8周低劑量組成模率達85%，存活率達100%。這和劉歐飛等[19]結果一致。實驗結果顯示對SD大鼠8周高脂飼養后，腹腔一次性注射STZ 25 mg/kg能復制穩定的2型糖尿病模型。

4 結論

4周齡大鼠進行高脂飼料喂養8周后，再進行STZ 25 mg/kg一次性腹腔注射，成模率和存活率均高，并且操作簡單，無需反復注射，形成穩定的2型糖尿病模型。本研究結果為今后2型糖尿病治療與機制探討提供了良好的大鼠動物模型。