外周血Th17與Treg細胞失衡與兒童EB病毒感染的相關性*

周洋 陳芳芳 王桂蘭 齊曦明 康厚鑫 吳小波

(秦皇島市第一醫院 1.兒科一病區;2.中心實驗室，河北 秦皇島 066000)

Epstein-Barr病毒，簡稱EB病毒(EBV)，是目前兒科臨床最常見的感染性疾病之一，主要通過唾液、輸血、器官移植等進行傳播，是導致腫瘤發生的主要病毒，其感染的普遍性及感染后終生潛伏而不能被機體免疫系統徹底清除[1-2]。兒童中非腫瘤性EBV感染疾病主要包括傳染性單核細胞增多(IM)、慢性活動性EBV感染(CAEBV)、EBV相關噬血淋巴組織細胞增生癥(EBV-HLH)，后兩種疾病是較為嚴重的EBV感染相關疾病，預后不良，病死率高[3]。但目前我國兒童EBV的流行病學、并發癥、臨床和實驗室檢查特征、機體對EBV的細胞免疫和體液免疫特點等缺乏系統性研究，而且對EBV相關疾病及重癥EBV感染的實驗室診斷、免疫學研究及相關治療報道較少。輔助性T細胞(T helper cell 17,Th17)、調節性T細胞(regulatory T cells,Treg)是近年免疫學研究的熱點[4-5]。有研究表明，其平衡機制及其相關因子白介素17(interleukin 17,IL-17)、轉化生長因子-β1(Transforming growth factorbeta 1,TGF-β1)的變化，在機體促進清除胞外病原體的入侵和炎癥反應中發揮著重要作用[6]。為了進一步探索Th17、Treg細胞在EBV兒童中表達的機制，本研究檢測EBV患兒、健康兒童外周血T淋巴細胞中Th17、Treg細胞、轉錄因子表達率及其相關特征性細胞因子(IL-17、TGF-β1)的水平變化，旨在從分子學水平對EBV的臨床診斷與治療提供進一步的免疫學支持，為兒童EBV的預防及疫苗的開發提供新的思路與方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年12月～2020年5月秦皇島市第一醫院兒科收治的EBV感染患兒58例(經實驗室檢查，EB病毒DNA、 EB病毒抗體檢測陽性的患兒，診斷為EBV感染)為EBV感染組。另選擇同期本院健康體檢兒童50例為對照組。納入標準：①所有EBV感染患兒診斷均符合胡亞美等編著的《諸福棠實用兒科學》[7]中的相關標準。②年齡 6個月～14歲。③均為首發EBV感染患兒。④患兒均處于亞急性感染階段。⑤患兒及家長知情并簽署知情同意書。排除標準：①特殊遺傳代謝性疾病者。②血液系統疾病者。③自身免疫性疾病者。④寄生蟲感染性疾病者。⑤腫瘤疾病者。本研究經醫院倫理委員會同意。

1.2 方法 EBV感染組于入院48 h內、對照組于健康體檢時采集空腹靜脈血6 mL，肝素抗凝，3500 r/min 5 min離心，留取上層血清，采用FACS流式細胞儀檢測外周血Th17、Treg細胞；采用TRIzol法提取細胞總RNA，以RORγt mRNA、Foxp3 mRNA特異性引物在PCR擴增儀上進行反轉錄酶-聚合酶鏈連鎖反應(RT-PCR)，反應條件25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，4 ℃長時間保存。經瓊脂糖凝膠電泳成像系統掃描，與內參照的條帶灰度值比值作為標準定量分析，計算待測樣本目的基因的相對表達水平；采用ELISA抗體雙夾心法檢測細胞相關特征性細胞因子IL-17、TGF-β1水平，嚴格按照說明書操作進行。

1.3 統計學分析 應用SPSS19.0軟件處理數據，計數資料以率(%)表示，行2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，行t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EBV感染組和對照組一般資料比較 EBV感染組和對照組性別、年齡一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 EBV感染組和對照組外周血Th17、Treg細胞表達率比較 EBV感染組患兒外周血Th17細胞表達率明顯高于對照組，Treg細胞表達率和Treg/Th17細胞比率明顯低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 EBV感染組和對照組外周血Th17、Treg細胞表達率比較

2.3 EBV感染組和對照組轉錄因子表達率比較 EBV感染組患兒RORγt mRNA表達率明顯高于對照組，Foxp3 mRNA表達率明顯低于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 EBV感染組和對照組轉錄因子表達率比較

2.4 EBV感染組和對照組細胞相關特征性細胞因子水平比較 EBV感染組患兒IL-17水平明顯高于對照組，TGF-β1水平明顯低于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 EBV感染組和對照組細胞相關特征性細胞因子水平比較

3 討論

EBV于1964年由Epstein、Barr等首次在非洲兒童惡性淋巴瘤(伯基特淋巴瘤)組織培養中被發現，屬于皰疹病毒γ亞科，為雙鏈DNA病毒[8]。EBV感染世界各地均有發生，多呈散發，也可引起小范圍流行，四季均可發病，患者和EBV攜帶者為傳染源，病毒大量存在于唾液腺及唾液中，可持續或間斷排毒數周、數月甚至數年，經EBV原發感染后，大多數患者無臨床癥狀，尤其是6歲以下幼兒多表現為隱性或輕型發病，但在兒童期、青春期和青年期，約50%的原發性感染者均表現為傳染性單核細胞增多癥(IM)[9-10]。血清流行病學調查顯示EBV在人群中的感染率超過95%[11]，發展中國家2歲以下兒童EBV血清陽性轉化率可達95%以上，EBV作為臨床主要的致腫瘤病毒，其感染的普遍性及感染后終生潛伏而不能被機體免疫系統徹底清除，故被稱為“無處不在的成功病毒”[12-13]。有研究報道發現了表現為慢性疲勞綜合征的慢性EBV感染，淋巴組織異常增殖可能為淋巴瘤的前期表現[14]。近年有研究顯示EBV感染患兒體內存在體液免疫紊亂、T淋巴細胞亞群失調及細胞因子分泌異常等多種免疫功能失衡，且這一現象與其病理和臨床表現有關[15-16]。

Th17、Treg細胞是近年發現的CD4+T細胞新亞型，研究表明，初始的CD4+T細胞在不同細胞因子的作用下，可以向不同的方向分化[17]。大量研究表明，Th17、Treg細胞不同于Th1和Th2細胞。根據人胸腺、扁桃體、淋巴結和外周血中對Th17、Treg細胞的檢測，證實Th17細胞可通過特征性分泌IL-17誘導粒細胞集落刺激因子、粒-巨噬細胞集落刺激因子、前列腺素E2及其他一些炎癥因子的表達產生強烈的致炎效應，參與各種自身免疫病、器官移植排斥反應和寄生蟲感染等多種疾病的促炎癥反應[18-19]。而Treg細胞是通過表面膜分子Foxp3，與其他細胞直接接觸或分泌抑制性細胞因子IL-17和TGF-β1等方式，來抑制體內的CD4+T細胞等多種免疫細胞的活化和增殖[20]。有研究表明，其平衡機制及其相關因子(Th17、TGF-β)的變化，在機體促進清除胞外病原體的入侵和炎癥反應中發揮著重要作用[21]。Th17與Treg細胞失衡與自身免疫性疾病、腫瘤、抑制免疫和寄生蟲感染性疾病的免疫調節密切相關[22]，但本研究納入對象中排除了上述疾病患者，可較好的避免其他因素的感染，本研究結果發現，EBV感染組患兒外周血Th17細胞表達率明顯高于對照組，Treg細胞表達率和Treg/Th17細胞比率明顯低于對照組，與國外Humblet-Baron S[23]等人研究相一致，但與之相比較，本研究還進一步深入分析了EBV感染患兒mRNA相關轉錄因子表達情況，結果顯示EBV感染組患兒RORγt mRNA表達率明顯高于對照組，Foxp3 mRNA表達率明顯低于對照組，提示調節性CD4+T細胞減少并由此引發的免疫抑制效應不足可能是EBV感染患兒免疫失衡的重要原因[24-25]，這也是本研究的創新點，但目前關于其具體機制研究報道較少，故仍有待于進一步研究。Th17和TGF-β是兩種誘導初始CD4+T細胞分化的關鍵細胞因子[26-27]，本研究EBV感染組患兒IL-17水平明顯高于對照組，TGF-β1水平明顯低于對照組，提示EBV感染患兒Th17細胞過度活化及Treg細胞表達不足可能與感染誘導的IL-17高表達及Treg/Th17失衡有關。

4 結論與啟示

EBV感染患兒外周血中Th17細胞及其調控因子IL-17水平增高，Treg細胞及其調控因子TGF-β1水平降低，從細胞和細胞調控因子水平證實EBV感染患兒體內存在Treg/Th17失衡。本研究仍存在不足之處，納入對象均為亞急性感染階段，未對EBV感染后不同階段進行比較研究，可能會對結果產生一定的影響，且其具體機制及能否通過臨床介導調控因子的表達控制患兒的免疫炎癥反應還需更多研究探討。