平邑甜茶童區和成年區葉片基因表達差異

王新亮，彭福田

（1 濱州學院學報編輯部，山東 256603）（2 山東農業大學園藝科學與工程學院，國家作物生物學重點實驗室）

植物個體發育的過程分為童期和成年期。Zimmerman[1]指出：“童期是果樹實生苗能花芽分化之前的一段時間，果樹的童期一旦結束，就具有了開花的能力”。果樹實生苗在空間上還存在一定的童區：以根莖為圓心，以童程（實生苗始果點至根莖的枝干長度）為半徑的半球體空間[2]。童區不能形成花芽，而成年區能形成花芽。

關于童期向成年期轉變的生理機制，學術界有3 種假說。“成花素假說”認為成花促進或抑制因子是一種簡單的、特異的和廣譜的激素，但是這種激素還沒有被分離和確認[3]；“營養分流假說”認為植株內部的源庫關系能調控所有與階段轉變和成花有關的因子，成花誘導時，莖尖得到比非誘導條件時更好的同化物供應[4]；“多因子控制假說”認為多種激素、代謝物、營養等物質參與成花誘導。遺傳變異、過去和現在的生長狀況對不同的種類或基因型或同樣基因型在不同的環境下導致復雜的不同的限制因子[5]。近年來，研究者已經克隆到許多與植物階段轉變或成花有關的基因，越來越多證據支持“多因子控制假說”[6-9]。

為了進一步了解果樹童區與成年區葉片在基因表達上的差異，本文以6 年生的平邑甜茶實生苗為試材，利用數字基因表達譜測序技術研究了在花芽分化期平邑甜茶童區與成年區葉片在基因表達上的差異，以期進一步揭示實生平邑甜茶由童區向成年區轉變的分子機制，為分子育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為6 年生平邑甜茶實生苗。花芽分化期（9 月5 日）分別取童區（Y2）和成年區（A2）的葉片儲存于-80 ℃用于提取RNA。

1.2 RNA 提取和cDNA 制備

用TRIzol（Invitrogen）試劑盒提取平邑甜茶葉片中的總RNA，并通過Dynabeads Oligo（dT）（InvitrogenDynal）分離得到mRNA。用DEPC 水溶解RNA，并用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測其質量。用Oligo（dT）作為引物合成cDNA 第一條鏈。

1.3 基因差異表達分析

基因差異表達分析由華大基因協助完成。反轉錄合成的雙鏈cDNA 用NlaIII 限制性內切酶消化，并用磁珠純化3′端cDNA 片段，然后在5′端接上Illumina adaptor1，再用MmeI 酶切CATG 位點下游17 bp 處，用磁珠去除3′片段，最后在3′端接上Illumina adaptor2，這樣就得到了21 bp 標簽庫。經PCR 線性擴增15 個循環后，用6%TBE PAGE 純化，然后通過Illumina 基因表達測序法測序。

1.4 原始數據處理

利用base calling 將測序得到的原始圖像數據轉化為序列數據，再經過特定處理轉化為堿基序列標簽。最后將所有標簽對應到Genome Database for Rosaceae 網站蘋果基因組V1.0（http://www.rosacea e.org/projects/apple_genome,Malus x domestica Geno me v1.0）[10]參考序列。

1.5 差異表達基因的篩選

差異表達基因的篩選標準：①不同處理間，同一基因的表達量存在2 倍及2 倍以上的差異；②錯誤率（false discovery rate FDR）小于0.001[11]。

2 結果與分析

2.1 標簽概況

樣品A2 產生了5 917 214 個原始序列，樣品Y2 產生了6 126 204 個原始序列。去除雜質序列后，A2 產生了5 635 494 個標簽，Y2 產生了5 825 279個標簽。與蘋果基因組預測基因（Apple Genome V1.0 predicted CDS）比對發現，A2 中有1 060 378個標簽對應到16 284 個基因上，Y2 中有1 216 762個標簽對應到15 719 個基因上（表1）。

表1 每個樣品獲得標簽數量

2.2 差異表達基因的確認與功能分析

通過與Y2 比較，在A2 中表達上調的基因有269 個，表達下調的基因有727 個。pathway 分析發現，差異表達基因中有606 個基因能對應到pathway中，排名前30 的已經在表2 中列出，差異表達基因主要集中在代謝途徑、次生代謝物的生物合成、植物激素信號轉導、植物-病原互作、核糖體、RNA轉運、苯丙烷類生物合成、淀粉和蔗糖代謝這些途徑中。

除了差異表達基因pathway 分析外，將差異比較大的基因（log2 Ratio（A2/Y2）≥7 or log2 Ratio（A2/Y2）≤-7）并通過NCBI 數據庫的BLAST 工具與其他植物的基因序列進行比對。比對發現，表達上調的基因中主要參與含氮化合物轉運與代謝，如：寡肽轉運蛋白（MDP0000292270）和谷胱甘肽轉移酶（MDP0000289011），生長素抑制蛋白（MD P0000323212），GTP 代謝相關基因（MDP0000617 187、MDP0000185787、MDP0000129000）。表達下調的基因涉及比較多的途徑如脫落酸合成（MDP0000929213 ），E3 泛素蛋白連接酶（MDP0000770377）等。但是它們中的部分序列仍沒找到明顯相似的序列，這說明這些序列可能在其他植物中研究較少或是蘋果中特有的（表3）。

表2 差異表達基因前30位通路分析

表3 表達差異比較大的基因

2.3 蔗糖和淀粉代謝酶編碼基因在童區與成年區葉片中的表達差異

通過pathway 分析，在差異基因中查找到19 個參與蔗糖和淀粉代謝的基因，其中3 個在成年區表達量高，16 個在童區表達量高。淀粉合成關鍵酶AGPase（MDP0000182948）和淀粉酶（MDP00002 32760、MDP0000397284）編碼基因在成年區的表達比童區低。蔗糖非發酵-1 型相關蛋白激酶 1（SnRK1）在植物糖信號轉導和代謝途徑中可能發揮著關鍵性開關的作用[12]，我們在蘋果預測基因中找到3 個SnRK1同源基因（MDP0000191788、MDP0000173500、MDP0000320932 ），其中MDP0000320932 在成年區的表達比童區高［Log2 ratio（A2/Y2）=1.46］（表4）。

表4 參與蔗糖和淀粉代謝的差異表達基因

2.4 赤霉素和細胞分裂素合成關鍵酶編碼基因的表達差異

赤霉素、生長素和細胞分裂素對花芽分化既有促進方面的報道，也有抑制方面的報道，不同類型赤霉素對蘋果花芽分化的作用不同[13]。在本試驗中，赤霉素合成主要酶編碼基因（柯巴基焦磷酸合酶基因）MDP0000305417 和MDP0000147908 在成年區葉片中的表達高于童區，都是142 倍；1 個細胞分裂素合成關鍵酶—異戊烯基轉移酶編碼基因（IPT）在童區葉片中的表達是成年區的4.6 倍（表5）。

表5 參與赤霉素和細胞分裂素合成的差異表達基因

2.5 成花基因的表達差異

隨著研究的不斷深入，現在的研究主要集中到對成花基因的克隆及其功能的研究上。本試驗中，4 個PAF1 復合體同源基因（MDP0000141365、MDP0000130422、MDP0000210032、MDP000014182 8）在童區葉片的表達分別是成年區葉片表達量的2.4、3.1、4.2、3.4 倍。1 個GI同源基因（MDP00001 71530）在成年區和童區葉片中的表達存在差異，其在童區葉片的表達量是成年區葉片的2.4 倍。本試驗也發現1 個與PnFL-2同源性較高的基因（MDP0000322348）在成年區和童區葉片中的表達存在差異，其在童區葉片的表達是成年區葉片的13.2 倍。PFT1同源基因MDP0000220114 在童區葉片的表達是成年區葉片的6.4 倍。DNA 甲基化能終止春化作用，延遲開花[14]。本研究5 個甲基化相關酶基因中有4 個（MDP0000171530、MDP0000259 734、MDP0000312110、MDP0000223161）在成年區葉片的表達低于童區葉片（表6）。

3 討 論

pathway 分析發現，差異基因中有606 個基因能對應到pathway 中，包括：碳和氮的固定、同化、代謝和降解，脂類合成和代謝，核酸代謝，次生代謝，植物激素信號等。因此，本研究也支持“多因子控制假說”。很多標簽不能比對到預測基因上，這說明蘋果基因組的預測基因可能并不完全。

表6 成花基因的表達分析

3.1 花芽分化過程中糖代謝相關基因的表達

花誘導后，植物莖尖分生組織中的蔗糖濃度會激增[15]，刺激細胞有絲分裂。蘋果屬植物施用葡萄糖、果糖或蔗糖后，能促進其成花。但甘露醇不能起到同樣的作用，說明蔗糖在花誘導中是作為營養物質，而不是調節滲透性[16]。King 等[17]研究發現，蔗糖是助劑，而不是成花誘因。通過pathway 分析，在差異基因中查找到19 個參與蔗糖和淀粉代謝的基因，其中3 個在成年區表達量高，16 個在童區表達量高。淀粉動員是花誘導早期的重要步驟[18]。淀粉合成關鍵酶AGPase（MDP0000182948）和淀粉酶（MDP0000232760、MDP0000397284）編碼基因在成年區的表達比童區低，說明可能淀粉合成和降解均降低。這時光合產物可能主要被運往花芽，為來年開花積累能量。SnRK1 在植物糖信號轉導和代謝途徑中可能發揮著關鍵性開關的作用[12]，我們在蘋果預測基因中找到 3 個SnRK1同源基因（MDP0000191788、MDP0000173500、MDP00003209 32），其中MDP0000320932 在成年區的表達比童區高，這表明SnRK1 也可能在成花誘導方面起一定的作用。

3.2 花芽分化過程中激素合成相關基因的表達

研究證明，赤霉素能促進擬南芥開花[19]。而不同類型赤霉素對蘋果樹花芽分化的作用不同[13]。超表達GA-20 氧化酶基因后，植物開花提前[20]。在本試驗中，赤霉素合成主要酶編碼基因（MDP0000305417 和MDP0000147908）在成年區葉片中的表達高于童區。說明蘋果可能通過赤霉素上調LEAFY的表達來促進花器官的發育[21]。1 個IPT基因（MDP0000295823）在成年區葉片中的表達低于童區。IPT 是植物異戊二烯類細胞分裂素［反式玉米素（tZ），二氫玉米素（DHZ），順式玉米素（cZ），異戊烯基核糖基腺嘌呤（iP）］合成的關鍵限速酶[22]。李廣等[23]研究發現，在花芽分化后期側柏葉片中的玉米素含量是降低的。本研究發現，成年區葉片中IPT表達量低于童區，可能是導致細胞分裂素含量降低的直接原因。

3.3 花芽分化過程中成花基因表達差異

在擬南芥中，FRI、FRL1、PAF1 和FLC 抑制花芽分化，而SOC1、FT、AP1 和LEAFY 促進花芽分化[21,24]。本試驗中，4 個PAF1 復合體同源基因（MD P0000141365、MDP0000130422、MDP0000210032、MDP0000141828）在成年區葉片的表達低于童區葉片。PAF1 復合體刺激FLC的表達來抑制AP1和LEAFY的表達，延遲成花，因此平邑甜茶成年區秋季可能主要靠下調抑制花芽分化的PAF1 復合體同源基因的表達的方式來上調AP1同源基因（MDP0000124429）最終達到花芽分化。另外，GI參與光信號生物鐘響應。OsGI超表達造成水稻延遲開花，而通過RNAi 沉默OsGI后的水稻開花提前[25]。但是擬南芥中GI表現出相反的功能[26]。本試驗也發現1 個GI同源基因（MDP0000171530）在成年區和童區葉片中的表達存在差異，其在成年區葉片的表達低于童區葉片，這說明它的功能可能和水稻OsGI一樣。Kim 等[27]報道，牽牛花PnFL-2受長日照誘導，其轉基因擬南芥在長日照條件下開花提前，PnFL-2 屬于TIFY 轉錄因子家族的ZML 亞族。本試驗也發現1 個與PnFL-2同源性較高的基因（MDP0000322348）在成年區葉片的表達低于童區葉片。據李肖琴[28]報道，MDP0000322348 雖然也屬于TIFY 轉錄因子家族，但其歸屬于TIFY 亞族，所以可能MDP0000322348 的表達特性和功能與牽牛花PnFL-2的不同。擬南芥光敏色素開花時間蛋白1（phytochrome and flowering time protein 1，PFT1）作用于光敏色素B 的下游調節FT的表達[29]。任保蘭等[30]發現，紅掌Aa PFT1在童期表達量高于成年期，而本研究發現，PFT1同源基因MDP0000220114成年區葉片的表達低于童區葉片。DNA 甲基化能終止春化作用，延遲開花[14]。齊思言[31]研究發現，蘋果基本不成花的腋芽基因DNA 甲基化水平明顯高于易成花的短枝頂芽。菊花葉片經短日照處理后DNA 甲基化也顯著降低[32]。石玉波等[33]認為，DNA甲基化降低與花芽分化之間具有一定的相關性。本研究發現4 個甲基化相關酶基因在成年區葉片的表達低于童區葉片，這說明甲基化也可能在調節平邑甜茶成年區花芽分化過程中起重要作用。