乳腺癌超聲造影指標與臨床病理及腫瘤相關成纖維細胞數量的相關性

崇樂，夏露花，趙亮，李維芝，冷曉玲

新疆醫科大學附屬腫瘤醫院1超聲科，2核醫學科，新疆烏魯木齊 830011；3咸陽市中心醫院超聲科，陜西咸陽712000

乳腺癌是女性惡性腫瘤的主要致死疾病之一，WHO最新關于中國女性癌癥數據報告中顯示乳腺癌年新發病例逐年增長［1］，乳腺癌高發病率對于其的診斷提出了更高的要求［2］。目前常用于診斷乳腺癌的手段有乳腺X線攝影、CT及MRI，但X線主要用于診斷鈣化性乳腺癌，其為重疊圖像，對致密性乳腺癌有一定的局限性，且具有一定放射性［3］；CT主要用于評估乳腺癌遠處轉移的分期，一般只作為補充檢查［4］；MRI對于乳腺癌的診斷有較高的敏感性，但其特異性較低，增加了良性病變的活檢率，而且價格昂貴［5］。近年較多研究發現超聲造影作為一種新檢查手段，對于乳腺癌的診斷有很好的效能［6］。超聲造影通過靜脈注入造影劑，提高乳腺腫瘤與周圍組織回聲對比，利用不同組織的灌注時相差異，提高超聲診斷敏感性，在二維超聲的基礎上，進一步觀察乳腺癌腫塊的血流灌注情況及與周邊組織的關系［7］。有學者發現腫瘤的血流分布與腫瘤周邊的微環境及相關因子密切相關［8］，腫瘤相關成纖維細胞（TAF）促進腫瘤轉移與侵襲［9］，是乳腺癌基質細胞轉化成輔助腫瘤生長的因子，是組成乳腺癌微環境重要的因子之一［10-11］，但TAF與乳腺癌超聲造影指標的關系目前缺乏充足證據［12-13］。本研究旨在探索乳腺癌常見臨床病理因子與超聲造影指標的關系，分析二者之間的相關性，分析臨床病理因子在超聲造影指標中的差異性，進一步探究TAF在不同區域的分布特點及其與超聲造影指標及臨床病理因子之間的相關性，從而論證乳腺癌超聲造影指標與臨床病理因子及TAF的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2018年1月～2020年6月收入新疆醫科大學附屬腫瘤醫院病理確診為乳腺癌并最終手術的119例患者，所有患者均有完整的臨床資料、手術病理資料。納入標準：臨床及影像學懷疑乳腺癌收住入院治療的患者，在超聲造影之前及術前未行空芯針活檢、放療、化療及內分泌治療，手術治療，需取得完整術后病理結果及淋巴結轉移情況，乳腺腫瘤<2個。排除標準：造影劑過敏，造血功能及心肝腎功能不全，其他部位原發灶，乳腺轉移性癌，一側乳腺的多中心性病變，超過普通超聲探頭的掃描范圍，且難以保證病灶旁乳腺組織的參照屬性，雙側乳腺癌，對于通過體格檢查及相關輔助檢查（胸部及腹部CT、骨掃描等）發現存在遠處轉移灶的臨床Ⅳ期病例予以排除。119例患者的年齡為28～85歲，其中導管內癌6例，浸潤型導管癌80例，浸潤型小葉癌20例，浸潤性癌合并原位癌13例，病灶最大徑0.6～8 cm，平均2.8 cm。納入的患者基本特征（表1）。本研究經倫理委員會審查并同意，實驗過程符合倫理學標準，所有患者均告知造影可能出現的狀況并簽署造影知情同意書。

1.2 儀器

檢查儀器采用Aix Plorer型超聲診斷儀（Supersonic Imagine），超聲造影劑采用聲諾維（Bracco）干粉劑，與5.0 mL生理鹽水稀釋震蕩備用［14］。

1.3 超聲造影檢查

患者取平臥位及側臥位，檢查雙側乳房及腋窩，觀察病灶，記錄象限、距皮膚及乳頭距離、大小、數目、回聲特征及血流分布特征［15］。根據北美放射學會制定的乳腺超聲BI-RADS分類標準，對乳腺腫塊進行BI-RADS分類［16］。再行超聲造影檢查，詢問患者詳細病史，準備搶救藥物及設備，簽署造影知情同意書，選取二維超聲檢查的最可疑的病灶位置，選取病灶得最大切面或病灶血流最豐富的切面，啟動超聲造影模式，經肘正中靜脈注射造影劑4.8 mL，后注入5.0 mL生理鹽水沖管。觀察造影過程中，患者體位不變及平靜呼吸，保持探頭穩定，并同時連續實時觀察病灶的動態灌注過程（3～5 min），且進行圖像的存儲［17］。由2位副高以上的超聲醫生在未知患者臨床資料的前提下閱讀所存儲的圖像，通過超聲造影顯像分析乳腺腫瘤灌注的血流形態學特征［18］。采用QLAB分析軟件，繞過腫瘤的滋養血管，對病變邊緣血流顯像最豐富區域及病灶旁乳腺組織取樣獲得ROI，得到不同區域時間強度曲線（TIC）。乳腺癌不同區域的界定方法如下：在同一深度、同一屏幕的乳腺腺體組織中，采用超聲造影后病灶增強范圍的邊界為活躍邊緣區域，取樣框采用橢圓形，繞過滋養血管。取活躍邊緣區域1 cm處為病灶正常區域。用美蘭標記腫塊的研究切面，在邊緣帶的取樣區域留下美蘭，并且在研究切面的皮膚層劃線［17,19］（圖1）。

表1 納入119例患者基本特征Tab.1 Basic characteristics of 119 patients included

圖1 超聲造影ROI取樣方法Fig.1 ROI sampling method for contrast-enhanced ultrasound.

1.4 免疫組化檢查

對TAF進行CD34和α-SMA的染色（連續切片法），結果CD34/α-SMA+為激活的成纖維細胞。成纖維細胞在光鏡下形態細長，核細長，CD34和α-SMA以間質成纖維細胞胞漿內呈現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性［20-21］。

1.5 統計學分析

采用SPSS22.0統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，組間比較行t檢驗；計數資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 超聲造影指標與臨床病理的關系

腫塊大小、組織學分級及臨床分期與超聲造影指標相關（P<0.05，表2）。

表2 超聲造影指標與臨床病理因子的關系Tab.2 Relationship between CEUS index and clinic-pathological factors

2.2 臨床病理因子在超聲造影指標的差異

當乳腺癌腫塊>2 cm，組織學分級較高，臨床分期早時，造影后腫塊范圍增大，呈高增強，灌注缺損的概率也高（P<0.05），當乳腺癌腫塊>2 cm，造影后呈現穿支血流的概率也高（P<0.05），當乳腺癌臨床分期較早時，造影后腫塊呈現增強邊界不清晰的概率也高（P<0.05，表3）。

2.3 乳腺癌活性邊緣區域與正常區域TAF在超聲造影特征中的差異

將乳腺癌活躍的邊緣區域與病灶旁乳腺正常組織區域間質中的腫瘤相關成纖維細胞認定為TAF，用免疫組化標記的方法及流式細胞術進行鑒定及標記，經過統計分析發現，乳腺癌造影后病灶的增強范圍在病灶邊緣區域、癌旁正常區域的TAF數量均無關聯（P>0.05），乳腺癌造影后是否出現充盈缺損在邊緣活躍區域的TAF的分布無關聯，但若出現充盈缺損，癌旁正常區域的TAF數量增加（P<0.05）；乳腺癌造影后如果呈高增強，病灶邊緣活躍區域的TAF數量較多（P<0.05），但病灶的增強程度與癌旁的正常區域的TAF數量無關（表4）。

2.4 乳腺癌活性邊緣帶與正常帶TAF在臨床病理指標中分布的差異

病灶大小與癌旁正常區域的TAF的數量無關系（P>0.05），但當病灶>2 cm時，活躍邊緣區域的TAF的數量較多（P<0.05）。臨床分期較早時，邊緣活躍區域、癌旁正常區域TAF的數量較多（P<0.05）。組織學分級高，兩個區域的TAF數量均較多（P<0.05，表5）。

2.5 超聲造影與乳腺癌惡性基質化區域性特點的關系

根據上述結果，增強范圍與TAF在2個不同區域的分布沒有關聯（P>0.05），但充盈缺損、增強強度與惡性基質細胞在3個區域的分布具有關聯。造影出現充盈缺損的乳腺癌的癌旁正常區域TAF數量較多，呈高增強的乳腺癌邊緣區域TAF數量較多，病灶>2 cm，乳腺癌邊緣區域TAF數量較多，臨床分期較早時，癌邊緣區域TAF較多，組織學分級較高時，兩個區域TAF數量較多（圖2）。

表3 臨床病理因子在超聲造影中的分布差異Tab.3 Distribution difference of prognostic factors in CEUS[n(%)]

表4 乳腺癌活性邊緣帶與正常帶TAF在超聲造影特征中的差異Tab.4 Difference of CEUS characteristics between active marginal band and normal band TAF in breast cancer(Mean±SD)

表5 乳腺癌活性邊緣帶與正常帶TAF在預后因子分布中的差異Tab.5 Difference of prognostic factor distribution between active marginal band and normal band TAF in breast cancer(Mean±SD)

3 討論

超聲造影是一種無創性檢查手段，診斷乳腺癌有重要的作用［22-24］。近年研究表明，超聲造影與乳腺癌的臨床病理有一定的關系［25］，為了進一步確定乳腺癌與臨床病理的相關性，本研究收集119例乳腺癌，研究其相關性及臨床病理在超聲造影指標中的分布差異，這與目前一些研究具有相同的論點［26］。但關于超聲造影、臨床病理及TAF因子三者之間的相關性研究還缺乏較明確的證據［27-28］。

有研究發現乳腺癌的腫瘤細胞與周圍間質有著復雜的關系［17］。TAF就是存在于腫瘤基質中被稱之為被“激活”的腫瘤相關成纖維細胞［17,29］，既往國外研究表明［30-31］，腫瘤相關成纖維細胞是一種“促癌因子”，它能分泌一些生長因子和蛋白酶類，這些因子利用旁分泌途徑作用于癌細胞和基質，加速癌細胞增殖，改變基質結構，促進腫瘤新生血管的生成，從而加強腫瘤的浸潤轉移［32］。分析乳腺癌超聲造影指標、臨床病理因子與其的關系能更加清晰評估超聲造影在腫瘤預后中的價值。

圖2 超聲造影后呈高增強的乳腺癌TAF細胞分布的區域性特點Fig.2 Regional characteristics of the distribution of breast cancer TAF cells with high enhancement after CEUS

本研究顯示，增強范圍在病灶活躍邊緣帶與正常帶的TAF分布均無關聯，即無論造影后乳腺癌病灶范圍是否大于二維超聲顯示的范圍，TAF在兩個區域的分布均沒有差異。增強范圍對乳腺疾病良惡病灶有較高的診斷效能，TAF數量與增強范圍的擴大無關，這表明增強范圍擴大的因素并是唯一相關，進一步推測可能與乳腺癌的周圍組織浸潤有關，存在一定的局限性。本研究顯示乳腺癌造影呈充盈缺損，病灶活躍邊緣區域的TAF數量多，造影呈充盈缺損提示乳腺癌病灶內微血管分布密集，則充盈缺損是與乳腺癌預后有較強關聯的造影指標，因此充盈缺損時TAF的分布特點說明TAF與腫瘤微血管具有相關性。造影后呈高增強，病灶邊緣活躍區域的TAF數量多，進一步驗證了TAF的分布與乳腺癌微血管密度的關系。本研究提示TAF數量與充盈缺損及增強程度的關聯表明，TAF數量分布于微血管密集的病灶。TAF在邊緣活躍區域的數量與腫瘤大小存在正增長，乳腺癌越大，邊緣區域的TAF數量越多，且TAF數量與臨床分期、組織學分級在乳腺癌各個區域均存在關系，表明TAF細胞的分布具有很強的評估預后的能力，也提示TAF是乳腺癌預后不良的因素。

本研究也發現乳腺癌邊緣活躍區域與癌旁正常區域的超聲造影特征與TAF的關聯并不一致，也研究了TAF數量與臨床病理因子的關系，發現TAF的數量在正常區域中與腫瘤大小無關系，但與臨床分級及組織學分級具有明顯的關聯，結果說明在組織分化程度差，轉移能力強的乳腺癌中，TAF存在數量更多，TAF在一定程度上反映腫瘤的分化和轉移能力，因此TAF細胞是乳腺癌惡性基質化體現。通過乳腺癌超聲造影、臨床病理指標及TAF三者之間的關系進行研究證明，TAF是乳腺癌的侵襲性相關的因素，且超聲造影對于乳腺癌的診斷及預后的評估能力具有重要意義［33］。