黃連根腐病土赤殼屬病原真菌的鑒定

伍曉麗,陳大霞,劉 飛,王 鈺,李隆云*

(1.重慶市中藥研究院種植研究所，重慶 400065；2.中國中醫科學院中藥資源中心重慶分中心，重慶 400065；3.重慶市中藥研究院大健康中心，重慶 400065)

【研究意義】黃連是我國傳統的名貴中藥材，為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch．)、 三角 葉 黃 連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云連(Coptisteetawal1．)的干燥根莖。以上3種分別習稱味連、雅連、云連，是我國內銷和出口的大宗藥用植物。其中，味連品質好，產量最高；黃連性寒，味苦，具有瀉火解毒、清熱燥濕的功效，使用十分廣泛。據不完全統計，13部宋代以前著作的3.2萬多個古方劑中，含有黃連的方劑有1760種，占5 %左右[1]。重慶市石柱縣是味連主產區，也是全國聞名的“黃連之鄉”，黃連產量約占全國總產量的60 %左右。石柱黃連于2006年獲得了“國家地理標志”產品稱號，目前石柱黃連的種植面積達3333 hm2[2]。黃連根腐病近年來在多個產地發生，造成減產3～4萬元/667m2，嚴重挫傷連農種植積極性，影響了該產業的發展。本項目組前期研究發現，根腐病是多種真菌復合侵染所導致的病害，目前已鑒定出少部分鐮刀菌屬的病原真菌，但還有一些病原真菌的分類地位尚不明確，開展這些病原菌的鑒定工作，對防治該病具有重要意義。【前人研究進展】黃連根腐病的相關研究報道很少，宋旭紅等通過Illumina高通量測度比較根腐病黃連根際土壤、健康黃連根際和未種植黃連的土壤的微生物群落，發現二者微生物群落有顯著不同：鐮刀菌屬的相對豐度，根腐病黃連根際土壤顯著高于健康黃連根際土；細菌種群豐富度，黃連病株根際土壤低于未種植黃連土壤和健康黃連根際土壤[3-4]。Luo X M等[5]發現，茄腐鐮刀菌是黃連根腐病的病原真菌之一，本課題組通過病根組織分離內生真菌，所分離出的真菌進行離體回接和活體回接篩選出病原真菌，分子鑒定和形態鑒定結果表明，尖孢鐮刀菌也是致病菌之一，它在黃連病根中分離頻率較高，是鐮刀菌屬的優勢菌，且致病力很強[6]。【本研究切入點】本課題組前期研究發現，根腐病病株根部土赤殼屬真菌分離頻率很高，且該屬真菌可能含根腐病病原[7]，但目前尚無相關研究報道。而準確鑒定出所有的病原菌是防治的基礎。【擬解決的關鍵問題】本研究采集石柱黃連根腐病植株根條，使用組織分離法進行可培養真菌分離后，通過離體根條回接和活體回接對其中的土赤殼屬真菌進行致病性檢測，對其ITS序列進行測序，測序結果與NCBI中的數據進行比對，分子鑒定結果結合形態鑒定，將病原菌鑒定到種，為黃連根腐病的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料、試劑及儀器參照文獻[7]。

1.2 試驗方法

1.2.1 可培養內生真菌分離與純化 分離培養方法參照文獻[7]。培養4～8 d后，挑取組織周圍長出的棕黃色、氈絨狀、生長緩慢的菌絲[8]，轉接PDA中純化，直到獲得純菌落。

1.2.2 可培養真菌分子鑒定 分子鑒定步驟參照文獻[7]。

1.2.3 離體回接 根據分子鑒定的結果，每一個菌種選擇1個菌株做離體回接，回接方法見文獻[6]。

1.2.4 活體回接 取離體回接發病嚴重的菌株做回接，回接方法及病情指數計算和病菌再分離見文獻[6]。

1.2.5 菌株形態鑒定 用插片法對致病菌進行形態鑒定。

1.2.6 致病菌遺傳變異分析 在研究過程中發現2株菌的菌落形態發生了變異，利用SeqMan軟件對2個變異菌株和它們的原始菌株ITS序列進行了突變位點比對分析。

2 結果與分析

2.1 土赤殼屬真菌分子鑒定結果

從黃連病根中共分離到土赤殼屬真菌38株(表1)，Ilyonectriadestructans、Ilyonectrialiliigena、Ilyonectriasp.isolate Cg07是其中的優勢菌。此外，5.6、B5在保存過程中菌株形態發生了明顯變化，菌絲變得更短、稀疏，由棕黃色變成了米白色，變異后的菌株編號分別是5.6W、B5W。

2.2 離體回接發病情況

離體回接結果表明，除5.6和10.4外，其余菌均有強弱不等的致病性，B5、5.6和它們的變異株致病性不同。因此挑取除5.6和10.4外的8個菌株做活體回接試驗，結果見圖1和表2。

2.3 活體回接發病情況

活體回接的根均有不同程度的發病(表3、圖2)，其中12.12病情指數最高，其次是12.4。B5和它的變異株致病性不同。發病的根部分或全部變黑腐爛。病情輕緩的植株葉片較正常，有新葉生長；病情嚴重的植株新芽極少或沒有，大量葉片枯死。而活體回接發病的根進行再分離，仍然能分離到回接所用菌株。

2.4 致病菌形態鑒定

選取致病性最強的兩株菌12.4和12.12進行形態觀察。

12.4(圖3)。菌落在PDA上生長慢，氣生菌絲很短，呈氈絨狀，幼嫩時白色，后變成棕黃色。菌落生長前期主要產生分生孢子，后期產生厚垣孢子。菌絲粗，直徑2.7～5.4 μm，黃色，有明顯的隔，節間向內縊縮，呈現臘腸狀。厚垣孢子多，球形或橢球形，光滑，間生或頂生，單生、成串狀或成簇生長，茶褐色，直徑11.5～16.7 μm。分生孢子梗多為單生。產生大分生孢子和小分生孢子。小分生孢子0～1 隔，無色透明，大小5.2～13.0 μm×2.2～5.3 μm；大分生孢子圓柱狀，稍彎，無色，1～3 隔，1 隔大孢子 19.7～35.4 μm×1.8～8.5 μm；2隔大孢子22.8～37.5 μm×4.2～7.5 μm；3隔大孢子38.1～43.4 μm×3.1～7.9 μm。分子鑒定結果表明該菌與I.destructansisolate 17eum01-01相似性99 %，而I.destructans是Cylindrocarpondestructans的有性型。參考龍月娟等的文獻報道[9]，將該菌鑒定為I.destructans(C.destructans)。

表1 黃連病根中土赤殼屬真菌的分子鑒定結果

表2 黃連根條離體回接結果

12.12(圖4)。菌落形態類似12.4。菌落生長前期主要產生分生孢子，后期產生厚垣孢子。顯微鏡下，菌絲形狀類似12.4，直徑3.6～6.7 μm。厚垣孢子很多，光滑，球狀或橢圓形，間生或頂生，單生或成串生長，淺褐色，直徑11.2～15.3 μm。分生孢子梗單生或分枝。分生孢子長圓形，無色透明，直或微彎，大分生孢子36.5～44.8 μm×8.8～10.3 μm，1～3隔，小分生孢子12.1～26.8 μm×5.9～7.6 μm，0～1隔。分子鑒定結果表明該菌與I.liliigenastrain G2相似性99 %。參考Ana Cabral等的文獻報道[10]，將該菌鑒定為I.liliigena。

2.5 突變菌株比對分析結果

菌株5.6和B5 ITS序列堿基的突變全部發生在該序列的兩端，包括堿基的突變和缺失。突變的堿基數不等，5.6有21個，B5有10個。2個菌的ITS序列堿基易突變區域都集中在兩端1～23個堿基以內(圖5)。

表3 黃連根條活體回接結果

3 討 論

本研究結果表明，土赤殼屬的Ilyonectriadestructans和I.liliigena是導致黃連根腐病的致病菌，而已報道的黃連根腐病菌均屬于鐮刀菌屬[5-6]。土赤殼屬的真菌作為植物根腐病病原菌報道的不多[11-12]。I.destructans能引起虎舌紅莖腐病[13]。I.liliigena導致百合根腐病，以其寄主王百合(Liliumregale)命名[10]。土赤殼屬的上述2個菌雖然導致黃連根腐病，但從根條腐爛程度看，其對根條的侵染能力不如鐮刀菌強[6]。這兩株真菌在病根中分離頻率比較高，也屬于主要病原真菌。

不少土赤殼屬菌株在PDA上培養過程中也會發生形態變異，由棕黃色變成米白色，菌絲變得更短。離體回接和活體回接的結果表明，其致病性也發生了變化。分子鑒定結果表明其ITS序列堿基也發生了突變。說明這類真菌變異性比較強。真菌在生長、培養過程中發生基因組的突變，導致其生理生化特征、毒性、致病性變化的現象比較常見。引起小麥赤霉病的禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw.)在PDA平板上可產生菌落角變，純化的角變菌株較親本菌落生長速度慢，分生孢子和子囊殼產生能力下降或喪失，對小麥寄主的致病力減弱[14]。蟬擬青霉[Paecilomycescicadae(Mique1) Samson]菌株在沙氏培養基上可產生孢子型和菌絲型兩類不同的突變菌株，它們和原始菌株相比較，胞外多糖、蛋白酶、SOD等的含量以及對甘藍蚜的致病性均有顯著變化[15]。由此也推測，在大田里，這些土赤殼屬真菌會不斷發生基因變異，導致其生物學特性和致病性變化，因此生產上靠單一農藥防控效果不好，需采用復配農藥制劑，同時結合調整栽培措施、土壤治理等手段進行綜合防治。

本研究雖然鑒定出了部分土赤殼屬的病原真菌，但以下問題有待深入探討：從分子鑒定結果看，本研究分離到的土赤殼菌有6種，活體回接結果表明，除了I.destructans和I.liliigena外，剩余的菌也有一定致病性，不排除它們在基因突變后，致病性增強的可能。因此，后期我們將對土赤殼屬病原真菌基因突變前后的致病性、耐藥性、生物學特性變化等問題開展深入研究。

4 結 論

采用分子鑒定和形態鑒定相結合的方法，對近年來流行的黃連根腐病病原菌進行鑒定，鑒定結果為Ilyonectriadestructans和I.liliigena，且這類土赤殼屬真菌基因易發生突變。