云南省副豬嗜血桿菌分離鑒定及其16S rRNA生物信息學分析

趙 津，吳林蔚，李 珂，趙國洪，楊鎖柱，王洪偉，韓建強*

(1.玉溪農業職業技術學院，云南 玉溪 653106；2.玉溪市疾病預防控制中心，云南 玉溪 653100；3.云南省畜牧獸醫科學院，云南 昆明 650224)

【研究意義】副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)引起豬的一種以急性敗血癥、多發性漿膜炎和關節炎為特征的疾病，主要感染斷奶后和保育階段的豬，常見于5～8周齡。在集約化豬場中，副豬嗜血桿菌病常在豬群遭受環境不良、轉群、去勢、免疫注射、飼養不當等因素影響，或者豬群感染繁殖與呼吸障礙綜合征等免疫抑制性疾病時伺機暴發，造成嚴重的經濟損失[1-3]。研究當地流行血清型和敏感藥物可以指導疫苗和藥物的選用。【前人研究進展】副豬嗜血桿菌對營養環境要求較高，除了需要胰蛋白大豆瓊脂培養基外，還需要添加V因子或者NAD，以及胎牛血清。近年來，副豬嗜血桿菌病已成為危害世界各國養豬業的典型細菌性疾病，該病在中國各省已有報道，各地方分離株對藥物敏感性和耐藥性有一定差異[4-10]。Kielstein等[11]用傳統的瓊脂擴散血清學法將副豬嗜血桿菌分為15型，另外有20 %的臨床分離株不能分型。Howell等[12-14]通過多重 PCR(multiplex PCR,m PCR)對副豬嗜血桿菌分子血清定型的方法與傳統的血清分型方法結果有很高的一致性。蔡旭旺等[4]從全國十多個省市分離出32株Hps，對其中15株進行瓊脂擴散血清分型，結果顯示血清5型3株、血清4型4株、血清13型2株、血清12型2株，另外有4株不能進行分型。朱小寧等[5]從湖南分離到12株副豬嗜血桿菌，通過16S rRNA序列進化分析，發現其中11株菌株與血清5型同源性最高。【本研究切入點】對云南規模化養豬場疑似副豬嗜血桿菌病例樣品，用TSA培養基進行細菌分離培養，觀察細菌形態學、進行生化試驗、觀察衛星生長現象、進行特異性片段PCR擴增和對確定菌株的藥敏試驗，以及對菌株進行mPCR分子血清定型和16S rRNA序列分析。【擬解決的關鍵問題】為云南規模化豬場的副豬嗜血桿菌疫苗和敏感藥物選用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料

采集云南省2個規模化豬場中疑似副豬嗜血桿菌感染，且具有典型病變的病豬內臟組織和心包液帶到實驗室進細菌分離。

1.2 主要試劑及菌株

胰蛋白大豆瓊脂(Tryptic Soy Agar,TSA)胰蛋白大豆肉湯(Tryptic Soy Broth,TSB)為英國OXOID 公司產品；GoldViewTM核酸染料、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子)和新生小牛血清購自生工生物工程(上海)股份有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；特異性引物由華大基因合成； PCRmix、DL2000TM Marker均購自廣州東盛生物科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純產品。陽性對照副豬嗜血桿菌Nagasak株(CVCC3895，血清型5型)由中國獸醫微生物菌種保藏管理中心購置、金黃色葡萄球菌由本實驗室鑒定保存。

1.3 細菌分離培養

從疑似病例的肺臟、關節液、心包液中無菌取樣，接種于TSA平板，37 ℃培養24～48 h，觀察菌落形態，純化后用TSB培養基培養保存。

1.4 染色鏡檢

挑取疑似菌落涂片，并進行革蘭氏染色，然后于顯微鏡下觀察細菌形態。

1.5 生化試驗

首先在葡萄糖、乳糖、半乳糖、木糖、甘露醇、尿素酶等微量生化管中分別添加NAD(終濃度為10 μg·mL-1)，將1.3純化培養的菌液加入各微量生化管，37 ℃培養24～48 h，觀察結果。同時，吸取純化培養菌液至潔凈玻片，分別進行接觸酶和氧化酶試驗[15]。

1.6 “衛星生長現象”試驗

在超凈工作臺內，挑取疑似菌落在鮮血瓊脂平板上水平劃線，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，放置恒溫恒濕培養箱于37 ℃培養24～48 h，看是否有“衛星現象”[16](靠近金黃色葡萄球菌菌苔的菌落較大，反之則菌落較小或無菌落生長)。

1.7 PCR檢測

擴增副豬嗜血桿菌(HPS)特異性基因的引物序列引用自Angen等[17]，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成(表1)，目的基因1090 bp。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。結束后，取10 μl擴增產物用1 %的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.8 multiple PCR分子血清定型

擴增副豬嗜血桿菌(HPS)15個型特異性基因和1個種特異性基因的引物序列引用自Howell等[12-14]，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成(表2)。PCR反應體系：PCRmix 12.5 μl，引物混合物(型特異性引物∶種特異性引物=1∶0.25)3 μl，模板DNA 2 μl，DMSO 0.25 μl，超純水7.25 μl，總體積25 μl。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，30個循環；68 ℃延伸5 min。結束后，取10 μl擴增產物用2 %的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，凝膠電泳時間90 min，以更好地分離擴增子。

表1 副豬嗜血桿菌(HPS)PCR特異性擴增引物

表2 副豬嗜血桿菌血清型基因擴增引物及產物大小

表3 細菌16S rRNA通用引物

1.9 16S rRNA序列分析

用細菌16S rRNA通用引物[18]擴增副豬嗜血桿菌16S rRNA基因序列(表3)，擴增產物與pESI-T載體鏈接，提取質粒送上海生工測序。應用MegAlign分析軟件，對分離的DYJ20160901、CH20190501菌株16S rRNA 序列與GenBank上公布的國內外不同血清型菌株16S rRNA序列進行遺傳進化分析，繪制系統進化樹。

1.10 藥敏試驗

將副豬嗜血桿菌純培養物均勻涂布于TSA平板上，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼于培養基表面，37 ℃培養48 h后測量抑菌圈直徑。根據杭州微生物試劑有限公司藥敏試驗紙片法的抑菌范圍標準判定藥物敏感程度。

2 結果與分析

2.1 病例剖檢結果

通過對云南省2個規模化豬場疑似副豬嗜血桿菌病例進行病理解剖，發現2例病例均出現“絨毛心”(圖1)、肺臟有纖維素性附著物，并且與胸膜黏

連(圖2)，胸腔、腹腔有黃綠色混濁積液，后肢跗關節腫大，有黃色清亮滲出液。

2.2 分離培養菌落形態觀察

從云南省2個規模化豬場病豬的肺臟支氣管分離到2株細菌，分別為DYJ20160901、CH20190501，菌落在添加NAD及小牛血清的TSA平板上生長良好，形成針尖大小、圓形、半透明、光滑濕潤的菌落(圖3)。

2.3 革蘭氏染色鏡檢結果

將純化后菌落涂片，革蘭氏染色后，顯微鏡下可見無芽孢和鞭毛、有莢膜的革蘭氏陰性桿菌，菌體形態多樣，短桿狀多見，也有長絲狀、球狀(圖4)。

2.4 生化培養特性

2株菌株均發酵葡萄糖、半乳糖，不發酵乳糖、木糖、甘露醇，接觸酶試驗為陽性，尿素酶、氧化酶試驗為陰性，符合副豬嗜血桿菌生化特性(GB/T 34750-2017)。

2.5 “衛星生長現象”試驗

通過“衛星生長現象”試驗，發現2株菌株靠近金黃色葡萄球菌菌苔的菌落較大，遠離金黃色葡萄球菌菌苔菌落較小，甚至無菌落生長(圖5)。

2.6 PCR檢測結果

應用副豬嗜血桿菌特異性引物對2株分離株進行PCR檢測，通過凝膠電泳結果顯示，2株分離株均有1090 bp的特異性條帶，與預期結果相符(圖6)。

2.7 multiple PCR分子血清定型

應用multiple PCR分子血清定型方法對DYJ20160901、CH20190501菌株進行分子血清定型，2株菌株均屬于血清5/12型(圖7～8)。

2.8 16S rRNA序列分析

使用DNA Star分析軟件中的MegAlign分析軟件，用Clustal W算法對分離的DYJ20160901、CH20190501菌株16SrRNA序列與GenBank上公布的國內外不同血清型菌株16S rRNA序列進行遺傳進化分析，繪制系統進化樹(圖9～10)。結果顯示2株菌株與Genbank中已公布的不同血清型HPS菌株同源性為97.3 %～99.6 %，DYJ20160901與Genbank登錄號為FJ667952的血清5型菌株構成一個分支，同源性為99.1 %；CH20190501與Genbank登錄號為AB078972的血清5型菌株構成一個分支，同源性為99.6 %。

2.9 藥敏試驗結果

從表4可見，2株菌株藥敏試驗高度敏感率達100 %的藥物：強力霉素、大觀霉素、頭孢噻肟、氟苯尼考、頭孢曲松鈉，耐藥率為100 %的藥物：林可霉素。2016年分離的DYJ20160901株對喹諾酮類藥物(恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星)均高度敏感，但是2019年分離的CH20190501株對以上喹諾酮類藥物均出現了耐藥性。

3 討 論

副豬嗜血桿菌的培養對營養環境要求較高，除了需要胰蛋白大豆瓊脂培養基外，還需要添加V因子或者NAD，以及胎牛血清，在添加時，需要注意無菌操作；副豬嗜血桿菌從豬肺臟支氣管、心包積液、胸腔積液、關節液中均可分離得到，其中又以豬肺臟支氣管較為容易分離，此外，需要注意的是采取的病料需在2 h以內分離細菌，則成功率較高。副豬嗜血桿菌在顯微鏡下形態多樣，可為短桿狀、桿狀、球狀、長絲狀，這與副豬嗜血桿菌培養時間有關，早期培養基，副豬嗜血桿菌形態多以短桿狀為主，陳舊培養基多以長絲狀為主。

近年來，由副豬嗜血桿菌引起豬的漿膜炎和關節炎在中國各地豬場時有發生[4,19-21]，云南尚未見系統的研究報道，筆者從云南省規模化豬場分離到2株疑似菌株，經培養特性、形態觀察、生化鑒定，以及PCR鑒定確定為副豬嗜血桿菌。由此說明，云南省存在副豬嗜血桿菌的流行。

藥敏試驗中發現，云南省2株分離株對強力霉素、大觀霉素、頭孢噻肟、氟苯尼考、頭孢曲松鈉高度敏感，對林可霉素出現耐藥性，2016年分離的DYJ20160901株對喹諾酮類藥物(恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星)均高度敏感，但是2019年分離的CH20190501株對以上喹諾酮類藥物均出現了耐藥性，分析原因，由于喹諾酮類抗生素具有抗菌譜廣、殺菌力強、作用迅速、體內分布廣泛等特點，被廣泛用于預防和治療畜禽疾病，養殖場長期使用喹諾酮類藥物，使副豬嗜血桿菌對其出現了耐藥性。薛國聰等[6]對廣東地區分離的7株副豬嗜血桿菌藥敏試驗，結果顯示其對氨芐西林、多粘菌素、慶大霉素高度敏感。張立憲等[6]對河南焦作地區分離的5株副豬嗜血桿菌進行藥敏試驗，結果顯示其對丁胺卡那、洛美沙星、頭孢噻肟、頭孢噻呋較為敏感。劉俊偉等[8]對河南3株副豬嗜血桿菌藥敏試驗，結果顯示其對左旋氧氟沙星高度敏感。周斌等[9]對華東地區13株副豬嗜血桿菌藥敏試驗，結果顯示其對頭孢類、阿莫西林等藥物敏感。魏光河[10]對重慶渝東部分地區分離的3株副豬嗜血桿菌進行藥敏試驗，結果顯示分離的3株疑似副豬嗜血桿菌菌株對頭孢類、粘桿菌素類高度敏感；對四環素類、喹諾酮類、青霉素類藥品明顯耐藥。由于副豬嗜血桿菌血清型較多，菌株間差異，敏感藥物也有差異。臨床藥物的使用仍需要藥敏試驗做指導。這樣可以避免盲目用藥，減少抗生素殘留，同時也降低養殖成本。

通過multiple PCR方法對分離的DYJ20160901、CH20190501菌株進行分子血清定型，顯示兩個菌株均為5/12血清型，將其16S rRNA序列與GenBank上公布的國內外不同血清型菌株16S rRNA序列進行遺傳進化分析。結果顯示2株菌株與Genbank中已公布的不同血清型HPS菌株同源性為97.3 %～99.6 %，DYJ20160901與Genbank登錄號為FJ667952(日本Nagasak株)的血清5型菌株構成一個分支，同源性為99.1 %；CH20190501與Genbank登錄號為CP001321(中國SH0165株)、AB078972(日本312株)、CP021644(美國29755株)、CP009237(中國KL0318株)的血清5型菌株構成一個分支，同源性為98.9 %～99.6 %。因此，兩株菌株初步鑒定為血清5型副豬嗜血桿菌，與中國主要流行血清型一致[5]，與李福祥等在云南分離的YN-1株血清型一致[22]。Kielstein等[11]通過對SPF豬毒力測定，發現血清1、5、10、12、13、14型為高毒力菌株，血清2、4、15型為中等毒力菌株，血清3、6、7、8、9、11型為無毒力菌株。分離的2株菌株均來自“絨毛心、胸膜炎、腹膜炎、關節炎”等癥狀比較明顯的病例，分離株毒力較強。不同血清型之間交叉保護性不強或無交叉保護作用，目前，尚無一種滅活疫苗可同時對付所有分離菌株[23]，該地區主要以血清5型副豬嗜血桿菌為流行菌株，因此，疫苗可以使用與分離株血清型一致、同源性較高的商品化菌株疫苗，這可為云南規模化豬場的副豬嗜血桿菌疫苗和敏感藥物選用提供科學依據。

表4 分離株藥敏試驗結果

4 結 論

從云南規模化養豬場疑似病例樣品中分離到的2株細菌(DYJ20160901、CH20190501)均為副豬嗜血桿菌血清5型；二者都高度敏感的藥物是強力霉素、大觀霉素、頭孢噻肟、氟苯尼考、頭孢曲松鈉。