發酵床飼養方式對豬情緒因子及抗抑郁因子P11基因mRNA表達的影響

秦 楓，潘孝青，邵 樂，翟 頻，楊 杰，張 霞，李 健，顧洪如*

(1.江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇 南京 210014；2.農業部種養結合重點實驗室，江蘇 南京 210014)

【研究意義】豬舍環境是養豬生產的制約因素之一，影響豬的正常生理行為。在規模化養殖環境下，豬經常表現出咬尾、咬耳、拱腹等異常行為，嚴重影響豬生理健康，進而造成生產損失。【前人研究進展】隨著動物福利重視程度的提高，自由舒適的養殖環境已引起國內外專家的廣泛關注[1-3]，動物福利已得到世界上100多個國家和地區的重視和發展[4]。為提高養殖福利，歐美等發達國家通過向傳統圈舍投放秸稈、干草、木屑、菌糠等農作物的方式來營造富集環境[3]。發酵床養殖是新興的生態養豬模式，在母豬生產[5]、育肥豬生長[6-10]有很好的效果，且可提高斷奶仔豬平均日增重[11-12]，降低料肉比[6]。發酵床養殖可以為豬提供自由舒適的富集環境，被認為是改善動物福利的有效養殖模式[13-14]。研究表明，發酵床飼養可通過對豬舍內環境和行為特征的影響，提高動物福利[14-15]。發酵床飼養可增加仔豬或育肥豬的站立、運動、探究等行為[6,16]。發酵床養殖能滿足豬天性的釋放，提高豬生理健康，但對豬機體生理的變化研究較少。【本研究切入點】本試驗以60日齡蘇鐘豬為試驗動物，研究發酵床飼養對豬情緒相關物質及抗抑郁因子P11基因mRNA表達的影響，探討豬機體生理的變化。【擬解決的關鍵問題】此研究結果為發酵床飼養改善動物福利提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 發酵床墊料制作

本試驗2012 年6-9 月， 在江蘇省農業科學院六合試驗基地進行。發酵床豬舍為經濟型鋼管大棚結構，頂部覆蓋聚乙烯遮陽網。發酵床為地下式發酵床，發酵池地面下挖70 cm，形成地下發酵池。于試驗開始前14 d，以風干重為基礎，將金針菇菌糠、木屑和稻殼按比例(3∶1∶1)放到發酵池中，均勻噴灑發酵菌劑(按比例稀釋)，翻耕調整水分(濕度約為55 %)，堆積發酵，當溫度約為70 ℃時即平鋪墊料，厚度約為70 cm。

1.2 試驗設計與管理

選取日齡(60 ± 3)d、體重為(28.4 ± 0.30)kg的健康蘇鐘豬60頭，隨機分為水泥地面飼養組和發酵床飼養組，每組設3個飼喂欄(即3 個重復)，每個重復分別為10頭，重復內公母各占一半。育肥前期，水泥地面飼養組和發酵床飼養組飼養密度均為1.0 m2/頭。育肥后期，為避免因動物糞尿排泄量的增加造成發酵床床體腐爛情況出現，在育肥前期結束后稱進行1 次飼養密度調整，即調整為2.0 m2/頭，試驗前統一驅蟲，試驗期為90 d。試驗日糧由上海新農飼料股份有限公司提供(313 型、314 型育肥飼料)。發酵床飼養組日常管理主要是進行墊料維護，將豬糞尿比較集中地方散開，每周墊料深耕1次(表層至30 cm)。水泥地面飼養組每天早上8：00 和下午16：00清糞1 次。試驗期間，每天09：00 和16：00 人工投料1 次，自由采食和飲水，免疫程序均按常規進行。

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 唾液采集與測定 于試驗結束前3 d，每個重復選擇3 頭進行唾液采集(每組5公4母)。為避免動物自身生理受晝夜節律變化的影響，采集于上午9：00-10：00 進行[17]。具體采集方法：用柄長為30 cm 醫用棉簽于育肥豬口中充分咀嚼直至棉球完全潤濕，每頭豬2個棉簽，4 ℃離心(4000 r/min,10 min)，-20 ℃冰箱保存，待測。5-HT、β-EP、Ach、Cortisol按試劑盒(南京建成生物工程研究所)規定的方法進行測定。

1.3.2 血清指標采集與測定 在育肥試驗第45天(即肥育前期，豬體質量為60 kg 左右)、第90天(即肥育后期，豬體質量為90 kg 左右)采血，每組選取15 頭，采用注射器耳緣靜脈采血10 mL，離心機4000 r /min 離心10 min，分離血清，-20 ℃保存用于相關指標的測定，5-HT、β-EP、Ach、Cortisol、Mg、Zn按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)規定的方法進行測定。試驗期結束，每組選擇體重相近豬5頭，空腹24 h 后，進行屠宰，采集腦部下丘腦，液氮保存，用于P11蛋白RT-PCR檢測。

1.4 RT-PCR檢測

Trizol 法提取樣品總RNA，樣品中RNA 濃度用紫外分光光度計(260 nm)測定。采用10 μl 反應體系，隨機引物將RNA 反轉錄成cDNA。實時熒光定量PCR 采用20 μl反應體系即10 μmol/L Forward primer 0.4 μl，10 μmol/L Reverse primer 0.4 μl，2 × qPCR Master Mix(SYBR Green)10 μl，RNase free H2O 7.2 μl，RT 產物2 μl。

以actin為內參基因，以腦部下丘腦組織cDNA作為模板，進行P11蛋白基因實時熒光定量PCR 檢測，用得出的CT 值制作擴增效率曲線。試驗采用比較Ct 法(2-△△Ct)進行P11蛋白 基因mRNA 相對表達量的統計分析。試驗以actin 作為持家基因，從而校正不同樣品初始模板量的差異，每個樣品重復3次，從而獲得平均Ct值，采用2-△△Ct法計算樣品間P11蛋白基因mRNA 的相對表達量。2-△△Ct法采用的公式如下：△△Ct=[Ct(目的基因，試驗樣品)-Ct(actin，試驗樣品)]-[Ct(目的基因，參照樣品)-Ct(actin，參照樣品)]。每個樣品的2-△△Ct值即是該樣品P11蛋白基因mRNA 的相對表達量。

表1 目的基因引物序列信息

1.5 數據分析

試驗數據經Excel 2010 初步處理后，采用SPSS17.0軟件中的獨立樣本T檢驗進行方差分析。以P<0.05 作為差異顯著性判斷標準。試驗數據以(平均值±標準誤)表示。

2 結果與分析

2.1 不同飼養方式對豬唾液中情緒物質的影響

由表2可見，唾液中，發酵床飼養組5-HT、Cortisol濃度顯著高于對照組(P<0.05)，β-EP、Ach濃度則無顯著差異(P>0.05)。

2.2 不同飼養方式對育肥前期豬血清情緒物質的影響

由表3可見，育肥前期(45 d)，發酵床飼養組豬血清β-EP、Cortisol、Zn濃度顯著高于對照組(P<0.05)，5-HT、Ach濃度有提高的趨勢(P=0.065，P=0.062)，Mg濃度則無顯著差異(P>0.05)。

2.3 不同飼養方式對育肥后期豬血清情緒物質的影響

由表4可見，育肥后期(試驗第90 天)，發酵床飼養組豬血清β-EP、cortisol、5-HT濃度顯著高于對照組(P< 0.05)，Ach濃度，則顯著低于對照組(P< 0.05)，Zn、Mg則無顯著差異(P>0.05)。

2.4 不同飼養方式對育肥后期豬下丘腦P11蛋白基因mRNA表達的影響

圖1為RT-PCR檢測數據統計結果，發酵床飼養組豬下丘腦P11蛋白基因mRNA相對表達量高于水泥地面飼養組，且有提高的趨勢(P=0.062)。

3 討 論

隨著畜牧業的發展，集約化飼養模式優點突出，但存在問題也逐步顯現，高密度飼養模式雖提高了單位產量，卻限制行為，減少人畜互動影響了家畜的健康及福利，直接或間接影響生產性能。單調環境影響家畜的正常生理行為，易造成家畜欲求不滿、甚至精神恐懼、挫敗感外顯沉郁，不利于動物福利及生產性能的發揮。發酵床模式能夠提供更好的畜舍環境，利于豬情緒天性的釋放，提高福利。5-HT、β-EP、Ach、Zn是機體內與學習認知、情緒密切相關的物質。本試驗中，發酵床飼養組豬唾液和血清中5-HT、Cortisol、β-EP的濃度顯著提高。已知5-HT參與情緒調節，通過神經傳遞機能的減退參與情緒障礙包括抑郁與焦慮的形成[18-20]。常用的抗抑郁藥主要是調節5-HT濃度，抗抑郁藥能提高突觸內5-HT水平來緩解抑郁。血漿β-EP可能是診斷抑郁癥的一種重要指標[21]。有研究認為抑郁癥患者血漿β-EP升高，也有研究表明抑郁癥患者血漿β-EP降低。Djurovic等[22]發現，內源性和非內源性抑郁癥患者血漿β-EP均低于正常組，且經治療后均有顯著上升。另有研究表明向大鼠腦室中注入β-EP能顯著增加5-HT的含量[23]。豬唾液和血清5-HT、β-EP含量的提高可以看出豬機體處于生理愉悅狀態。

表2 不同飼養方式對育肥后期豬唾液中情緒物質的影響

表3 不同飼養方式對育肥前期豬血清情緒物質的影響

表4 不同飼養方式對育肥后期豬血清情緒物質的影響

探究行為是豬固有的遺傳習性，是其在野生狀態下生存的重要手段，主要以嗅、啃、拱等行為加以體現。豬探究行為動機主要來源于兩個方面[24]，一方面是尋找食物或尋找舒適地方躺臥即外在探究(欲求探究)，另一方面搜集周圍生活環境信息即內在探究(好奇探究)。探究行為是一種積極行為。豬的探究行為是動物福利的重要指標，反映豬認知學習、情緒生理。集約化的養豬環境中，物質貧瘠，嚴重剝奪豬的探究行為，大多數豬表現“無精打采”，甚至沉郁。發酵床養殖能夠增加仔豬和育肥豬的探究行為[6,16]。Lay 等[25]研究也發現發酵床飼養能夠增加豬玩耍行為，降低異常行為。Ach和Zn與認知學習行為密切相關。Ach由大腦、海馬、皮層等區域釋放，促進學習、記憶、注意、自發活動、探究等認知活動[26]，鋅離子在大腦中發揮第二信使作用[27]，哺乳動物的大腦皮層、海馬和杏仁核中發現了谷氨酸能神經元中有大量富含鋅的囊泡，影響學習、記憶、認知及情緒[28]。發酵床提供了較大的自由空間，增強了豬的認識學習活動。育肥前期發酵床飼養組中豬血清Ach、Zn濃度顯著提高。由此可見，發酵床養殖可以顯著提高豬唾液或血清的情緒物質，釋放豬的運動天性，使豬群情緒處于愉悅狀態，生理行為福利顯著改善。本次試驗中，還發現發酵床飼養組唾液或血清Cortisol顯著高于傳統水泥地面組。皮質醇測定樣本來源主要有兩種，即血液和唾液。目前，關于富集環境飼養對豬唾液中皮質醇含量的影響存在爭議。朱洪龍等[16]研究報道，發酵床飼養組唾液中皮質醇濃度顯著高于傳統水泥地面組。Klont等[29]研究也表明，富集環境飼養組豬唾液皮質醇濃度顯著高于未墊草的傳統飼養組，這均與本次結果相一致。但Morrison 等[6]研究發現，與傳統水泥地面相比，發酵床飼養對豬唾液皮質醇含量無顯著影響。De Jong 等[30]報道，11周齡時富集環境飼養組仔豬唾液皮質醇含量低于未墊草的傳統飼養組。發酵床飼養為豬提供自由、舒適的生活環境，一定程度讓豬回歸自然狀態，滿足了豬翻拱覓食等習性，這可能對豬下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸內分泌系統產生了影響，從而引起皮質醇的升高。且整個試驗期發酵床飼養組豬并未處于應激狀態，沒有影響生產性能，發酵床有可能提高了豬對環境變化的耐受性。皮質醇的升高可能還會對后期運輸有影響，但還需進一步的研究。

P11蛋白(又名S100A10) 參與抑郁癥發病，并起抗抑郁作用[31]。P11蛋白在腦、心、胃腸道、腎、肝、肺、脾臟、睪丸、表皮、大動脈以及胸腺等[32]組織廣泛表達。在腦部，P11 蛋白表達區域包括大腦皮層、海馬、下丘腦、中縫核以及伏隔核等。在抑郁大鼠和H/Rouen小鼠( 抑郁的基因動物模型) 中p11 mRNA和蛋白水平在前扣帶回和腹側紋狀體(尤其是伏隔核)下調；在抑郁癥自殺患者的海馬和杏仁核中p11 mRNA水平下降[29]。Cattaneo等[33]2013年在一項抑郁癥藥物治療的基因組研究項目(GENDEP) 中發現，外周血白細胞p11 mRNA 在抑郁患者中表達下降，8周抗抑郁治療后其表達上調。P11蛋白發揮抗抑郁作用一種途徑可能與5-HT相關，p11蛋白會與5-HT受體在抑郁相關多個腦區的細胞表面共定位和相互作用[34-35]，5-HT 可調節p11基因的表達[36-37]。本試驗中，發酵床飼養組P11蛋白基因mRNA相對表達高于水泥地面飼養組，P11蛋白的表達與5-HT、β-EP等情緒物質相一致。由此可見，發酵床養殖確實能改善豬群情緒生理，有很好的福利作用，豬群心理健康愉悅，從而能提供更為安全的產品。

4 結 論

在本次試驗中，發酵床飼養組能顯著提高豬群唾液和血清中5-HT、β-EP、Cortisol，提高育肥前期血清中Ach、Zn的濃度，并能夠提高腦部下丘腦P11蛋白基因mRNA表達。發酵床養殖環境可改善豬群的生理情緒，提高認知運動能力，豬群獲得更好的愉悅感，生產更健康的產品。