不同炮制方式的續斷HPLC指紋圖譜及化學計量學研究

潘 俊，李智敏，吳麗華，石 瑤，黃 慧，李晚誼，張 庭，王曉兵，肖 丹*

(1.云南省農業科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650200；2.云南省農業科學院農產品加工研究所，云南 昆明 650223；3.云南農業大學熱帶作物學院，云南 普洱 665099；4.貢山縣茨開鎮農業綜合服務中心，云南 貢山 673500)

【研究意義】中藥材的炮制是為了改變原材料的藥性和降低毒性，提高中藥在臨床治療中的效果和用藥的安全性，炮制技術在不同程度上對中藥材中有效成分有影響[1]。中藥指紋圖譜是現代中藥質量控制和評價的基石和核心技術，因其具有特征性、專屬性、可量化性、穩定性、有效性、完整性及細節處理的模糊性等特點，可以表達中藥的整體特性，是一種合理的中藥質量控制模式[2]。化學計量學(Chemometrics)是在化學測量過程中所使用的某種特定數學方法或統計學方法與數據交互關系的科學，能對整合后的色譜、光盤數據進行多元統計分析[3-5]。中藥指紋圖譜與化學計量學相結合，對中藥材品質進行更全面、準確的評價。續斷開始記載于《神龍本草經》，列為上品，傳統為補陽藥[6]。藥用部位為植物川續斷(DipsacusasperoidesWall.ex Henry)的干燥根；主治肝腎不足，腰膝酸軟、風濕痹痛，跌撲損傷等病癥[7]。續斷化學成分主要有三萜皂苷類、生物堿類、揮發油類、環烯醚萜類、多糖類以及其它一些成分[8-11]。【前人研究進展】續斷作為云南道地藥材，運用指紋圖譜與化學計量學相結合，對其炮制前后的質量評價研究較少。焦濤等利用HPLC-ELSD指紋圖譜分析方法對續斷炮制前后的內在成分進行研究，結果顯示續斷炮制前后化學成分有差異[12]。羅君等利用HPLC指紋圖譜技術，對續斷生品和酒炙品的化學成分進行分析研究，結果顯示綠原酸及川續斷皂苷Ⅵ的含量較炮制前有增加[13]。【本研究切入點】依據液相色譜的指紋特性，利用液相色譜法對11批不同產地的續斷藥材進行質量評價。【擬解決的關鍵問題】采用高效液相色譜法結合化學計量學對不同炮制方法的續斷進行指紋圖譜研究，旨在為續斷質量評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

續斷樣品來源于不同省份藥材市場采購獲得，經云南省農業科學院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為川續斷科川續斷(DipsacusasperoidesC.Y.Cheng et T.M.Ai)的根莖，詳細信息見表1。

表1 續斷樣品Table 1 The sample of Dipsacus asperoides

1.2 試劑

川續斷皂苷Ⅵ購買于北京中科質檢生物有限公司;乙腈(GR，美國 Sigma)；水(自制超純水)；甲醇(AR，天津市風船化學試劑科技有限公司)。

1.3 儀器

LC20A高效液相色譜儀(日本島津公司)； DGG-9123AD電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)；AX124ZH電子天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)；BL10-250A超聲波清洗機(上海比朗儀器有限公司)；UPT-I-20T純水器(成都超純科技有限公司)； HH-4數顯恒溫攪拌水浴鍋(金壇區西域新儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，DS-5 μm，12 nm)；流動相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，5 %B；5～12 min，15 %B；12～27 min，25 %B；27～42 min，30 %B；42～55 min，35 %B；55～60 min，35 %)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；檢測波長：212 nm；進樣量：20 μl。

1.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取續斷皂苷VI對照品2 mg，加甲醇配制成含續斷皂苷VI 2 mg·mL-1的溶液，即得。

1.4.3 供試品溶液的制備 續斷1號樣品0.5 g，甲醇25 mL，置入具塞錐形瓶，搖勻，稱重，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，冷卻，稱重，甲醇補足重量，過濾，取濾液5 mL，甲醇稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜即得。

1.4.4 供試品溶液測定 供試品溶液進樣量為20 μl，按“1.4.1”項色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。

1.5 數據處理

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(中國藥典委員會2004A 版)對數據進行相似度分析。采用SPASS 25.0軟件對數據進行系統聚類、K-均值方法及主成分分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度試驗 以續斷樣品S1號為對象，以“1.4.3”項方法處理樣品， “1.4.1”項色譜條件測定色譜數據，重復進樣6次，考察樣品中共有峰的相對保留時間和峰面積。結果顯示考察項前者的RSD為0.76 %，后者的RSD為4.15 %，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復性試驗 以續斷樣品S1號為對象，以“1.4.3”項方法處理樣品，重復稱取0.5 g樣品6份，依次進樣，考察樣品共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果顯示考察項前者的RSD為0.81 %，后者的RSD為3.98 %，表明方法重復性良好。

2.1.3 穩定性試驗 以續斷樣品S1號為對象，以1.4.3項方法處理樣品，分別在24 h內每隔2 h進樣分析，考察樣品共有峰相對保留時間和相對峰面積。結果考察項前者的RSD為0.57 %，后者的RSD為4.03 %，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2 HPLC指紋圖譜建立

取15批續斷樣品，以1.4.3項下制備供試品溶液，按1.4.1項下的色譜條件進樣，記錄色譜數據。在實驗條件一致的情況下，以色譜峰保留時間和紫外掃描圖譜為比較參數，色譜圖匹配得到23個共有峰，峰面積和保留時間見表2，色譜指紋圖見圖1。

表2 15批續斷樣品的共有峰保留時間及相對峰面積Table 2 Relative retention time and relative peak area of common peak for 20 batches of Dipsacus asperoides

2.3 共有峰面積及樣品相似度計算

為避免圖譜直觀分析的主觀性對分析結果的影響，將15批藥材樣品的HPLC圖譜信號數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(中國藥典委員會2004A 版)，圖譜中由于15號峰分離度良好，峰位居中，峰面積較大，穩定性好，所有樣品共有，因此設定15號為參比峰，色譜圖進行自動匹配，中位數法生成對照圖譜，時間窗寬度設為0.10 s，計算15批藥材的相似度。相似度結果見表3。各樣品色譜疊加圖見圖1。

表3 15批續斷HPLC指紋圖譜相似度評價Table 3 Similarity analysis of HPLC fingerprints of fifteen batches of Dipsacus asperoides

以續斷藥材共有模式為標準，進行整體相似性評價，15批續斷樣品的相似度分析結果見表3。指紋圖譜分析結果表明，所測樣品中有11 批續斷藥材指紋圖譜中位數相關系數在 0.900～0.99，相似度較高，達到了相似度的基本要求，說明樣品比較好。其中樣品(S1、S2、S3、S6、S7、S9～S12，S15)質量差異較小，相似度均大于0.9。編號 S4、S5 、S8 、S13、S14 的藥材指紋圖譜相關系數小于0.90 (大于0.850 )，樣品有一定的差別。

2.4 化學計量學分析

2.4.1 聚類分析 續斷樣品的色譜數據通過IBM SPSS 25.0軟件進行分析，以峰面積作為變量，對11批續斷藥材進行聚類分析。結果顯示，當分類距離d=5時，15批次續斷樣品聚為2類，編號為S1～S12的樣品聚為第一類，為干燥、發汗處理的樣品；編號為S13～S15的樣品聚為第二類，是用酒、鹽炮制的加工品(圖2)。

2.4.2 主成分分析 將15批續斷樣品的23個共有峰峰面積用IBM SPSS 25.0統計分析軟件中的因子分析進行主成分分析，以主成分特征值>1和方差貢獻率>85 %作為選擇主成分的依據。提取到6個主成分因子，其特征值>13.0，累積方差貢獻率為86.99 %，即包括大部分信息，根據主成分分析得到所有樣本的PCA二維投影圖見圖3，圖中每一個點對應一個樣本，共分為2類，與聚類分析結果一致。

3 討 論

3.1 流動相的確定

通過對流動相的篩選比較，采用乙腈-水梯度洗脫能使峰集中在3～55 min內得到較多的色譜峰，實現色譜峰的分離度好、基線漂移小的實驗要求。

3.2 指紋圖譜相似度評價

通過對15批樣品的指紋圖譜數據的分析，發現樣品HPLC指紋圖譜有一定差異，但都擁有相同的色譜特征峰，經《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》相似度計算顯示，15個樣品的相似性一般，編號 S4、S5、S8、S13、S14 的藥材指紋圖譜相關系數小于0.90(大于0.850)，與其他批次的續斷樣品相比，差異性大。說明產地和加工方法對續斷藥材的質量都有影響。

3.3 聚類分析與主成分分析評價

運用化學計量學中的聚類分析和主成分分析方法對15批續斷樣品的HPLC指紋圖譜數據進行處理，續斷樣品得到了很好的聚類效果，主成分分析的二維得分圖與聚類分析得到的結果一致，可以看出，干燥和發汗方法對續斷中化學成分的影響小于酒制、鹽制對續斷藥材的影響。續斷皂苷Ⅵ的含量可以看出酒制和鹽制對續斷藥材有效成分的含量有較大影響，發汗對續斷藥材有效成分的含量影響較小。

4 結 論

方法學考察結果顯示，實驗采用的色譜方法穩定、準確、重復性好，有效分離并獲得較多的特征峰，此方法可行，簡便快捷，為控制和評價炮制后續斷藥材的質量提供參考。本研究結論與樊媛潔[14]研究結果一致，炮制技術中增加輔料不僅使續斷中皂苷類成分發生變化，對其他有效成分也具有一定影響，所含有效成分的種類和含量有差別。