癌癥易感性基因15在腫瘤發生和發展中的調控作用及機制研究

趙俞喬，劉 浪，關滄海，姜興明

長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs, lncRNAs)是一類轉錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，因其缺乏開放性閱讀框而不具備或只具備有限的編碼蛋白質能力[1-3]。越來越多的證據表明，lncRNAs不僅參與諸多生物學過程，同時還在微小RNA(miRNA)前體剪接、轉錄干擾、轉錄后調控和染色質修飾等多個方面發揮作用[4-7]。此外，lncRNAs被發現在人體多種惡性腫瘤中呈現異常表達并調控腫瘤的發生和發展[8-9]。癌癥易感性基因15(cancer susceptibility 15, CASC15)，又名CANT、LINC00340或lnc-SOX4-1，是一個定位于染色體6p22.3的lncRNA。目前，有研究表明CASC15不僅在白血病和心肌肥厚等疾病中發揮重要作用[10-11]，還在多種惡性腫瘤中表達異常，在腫瘤的診斷、治療和患者預后評估等方面有著潛在應用前景。本文就CASC15在腫瘤發生和發展中的調控作用及機制作一綜述如下。

1 CASC15與消化系統腫瘤

1.1胃癌 胃癌是常見的消化系統腫瘤[12]。Yao等[13]對TCGA和GEO數據庫中相關文獻進行分析，結果顯示CASC15在胃癌中高表達；并采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)對60例胃癌和40例健康體檢者的臨床樣本進行定量檢測也得到相同結果。后其進行統計學研究發現高水平表達的CASC15與胃癌更大腫瘤體積、更高TNM分期和患者不良預后密切相關，CASC15在低分化程度胃癌細胞MKN453中比分化較好胃癌細胞MKN28中表達更高；采用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)下調胃癌細胞內CASC15的表達能夠抑制腫瘤增殖能力，而胃癌細胞內過表達CASC15可以得到與上述相反的結果。在上述研究的基礎上，Wu等[14]進一步研究發現外源性沉默CASC15可以阻滯細胞周期于G0/G1期、加速細胞凋亡，同時抑制上皮間質化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)進程，從而抑制腫瘤增殖、遷移、侵襲并影響裸鼠移植瘤的生長和轉移能力。亞細胞分離定位測定結果顯示CASC15同時存在于細胞核和細胞漿：細胞核內CASC15通過攜帶EZH2(enhancer of zeste 2)和WDR5(WD repeat domain 5)到抑癌基因CDKN1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A)的啟動子區域以抑制其轉錄；而在細胞漿中的CASC15可以作為ceRNA(competing endogenous RNA)直接結合miR-33a-6p從而上調促癌基因ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox)的表達。

1.2結直腸癌 Jing等[15]研究發現CASC15在結腸癌組織和細胞中呈異常高表達，并且其表達水平與TNM分期和淋巴結轉移密切相關。其進行的細胞實驗中利用短發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)沉默CASC15表達后發現能夠抑制體外腫瘤細胞的增殖與遷移、侵襲。進一步的機制研究證實，CASC15通過與miRNA相互作用來內源性海綿吸附miR-4310，阻斷miR-4310與下游靶基因LGR5(leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5)mRNA3'-UTR(untranslated region)的結合，從而上調促癌基因LGR5表達。此外，高表達的LGR5能夠激活Wnt/β-catenin信號通路，Wnt/β-catenin活化與腫瘤的增殖及遷移、侵襲密切相關。另有研究指出在奧沙利鉑(oxaliplatin, OXA)耐藥的結直腸癌中CASC15表達上調更為顯著,且高表達CASC15組整體生存時間更短;下調CASC15表達可以促使化療抵抗的HT29和HCT116細胞恢復對OXA的敏感性[16]。隨后的機制研究證實,CASC15通過競爭性結合miR-145來抑制ABCC1(ATP binding cassette subfamily C member 1)的表達從而增加OXA抗性作用；過表達miR-145或敲低ABCC1與下調CASC15在OXA抗性中的功能作用等效，而上調CASC15可部分逆轉這一結果[16]。

1.3肝癌 He等[17]利用qRT-PCR定量檢測發現,CASC15在肝癌組織中的表達明顯升高，且與腫瘤大小、腫瘤轉移和TNM分期顯著相關；Kaplan-Meier法生存曲線分析顯示高表達CASC15組預后更差。利用siRNA抑制CASC15表達后腫瘤細胞增殖和遷移、侵襲受到抑制，同時阻滯細胞于G0/G1期并加速細胞凋亡；體內試驗中沉默CASC15可以減緩皮下移植瘤的生長速度。Li等[18]通過生物信息學分析發現在肝細胞癌中CASC15具有3個共表達基因：TWIST1(twist family bHLH transcription factor 1)、Sox4(SRY-box transcription factor 4)和VCAN(Versican)，并且上述共表達基因均與EMT進程密切相關。Western Blot結果證實CASC15能夠正向調控Sox4和VCAN的蛋白水平；AGO2-RIP(Argonaute 2-RNA)免疫沉淀和熒光素酶報告實驗結果表明，CASC15通過與miR-33a-5p特異性結合來上調miR-33a-5p靶基因TWIST1，并且TWIST1通過上調N-cadherin和Vimentin表達的同時下調E-cadherin來調控EMT進程，從而促進腫瘤的增殖和遷移、侵襲，抑制細胞凋亡。另外，有進一步研究證實高表達CASC15可以通過促進下游基因Sox4的轉錄進而激活Wnt/β-catenin信號通路，從而增強腫瘤的惡性生物學行為[19]。

1.4肝內膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC) 有研究發現在ICC組織中CASC15表達顯著提高，并且高表達CASC15提示較大腫瘤體積、高手術風險、高惡性程度及較差預后。在CCLP、9810、HuCCT1和RBE 4種ICC細胞中轉染siRNA-CASC15后，ICC細胞的增殖和遷移、侵襲能力受到抑制且細胞凋亡加速。RNA pull-down實驗和質譜分析結果顯示，PRDX2(Peroxiredoxin 2)可以與CASC15結合；Western Blot分析表明,PRDX2的表達隨著CASC15的敲低而降低。進一步實驗證實,過表達的PRDX2能夠部分逆轉敲低CASC15對PI3K/AKT信號通路的抑制作用。綜上，CASC15可能通過誘導PRDX2/PI3K/AKT軸在ICC中發揮其調控作用[20]。Merdrignac等[21]在ICC細胞中發現異常表達的TLINC(TGF β-induced long noncoding RNA)，即CASC15，其表達水平可受轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)的誘導而提高；同時TLINC被鑒定為上皮細胞和基質細胞中表達的腫瘤標志物，而對應非腫瘤部位的基質中僅在具有膽管炎癥反應的特定區域表達。由于選擇性剪接，TLINC可產生不同的轉錄本，包括上皮表型相關的長TLINC亞型(TLINC-L)和間質表型相關的短TLINC亞型(TLINC-S)；TLINC-L還與ICC遷移表型和促炎細胞因子(如白細胞介素-8)的誘導相關。

2 CASC15與婦科腫瘤

2.1宮頸癌 宮頸癌是具有較高復發率與侵襲性的婦科腫瘤[22]。Shan等[23]利用qRT-PCR定量檢測宮頸癌62例的組織樣本后發現，相比于癌旁正常組織，宮頸癌組織內CASC15的表達明顯上調，且其表達水平與國際婦產科聯盟(international federation of gynecology and obstetrics, FIGO)分期和淋巴結轉移密切相關，CASC15高表達患者術后生存時間更短。利用siRNA下調宮頸癌細胞內CASC15的表達后能夠抑制細胞增殖和侵襲、阻滯更多的細胞于G1期，并且通過上調E-cadherin和下調N-cadherin的表達來抑制EMT發生。此外，CASC15多態性與宮頸癌易感性間存在潛在的相互作用[24]。

2.2卵巢癌 與其他惡性腫瘤不同，CASC15在卵巢癌組織和細胞中表達降低，并且低表達的CASC15與FIGO分期、腫瘤大小及分化程度相關。Kaplan-Meier法生存曲線分析結果表明低CASC15表達水平患者的總生存期和無進展生存期更短；受試者工作特征曲線分析發現CASC15對腫瘤組織和非腫瘤組織的鑒別具有一定價值。此外，過表達CASC15可抑制腫瘤的增殖和遷移、侵襲，阻滯細胞于G0/G1期并加速細胞凋亡。進一步的實驗結果表明CASC15通過與miR-221直接作用來降低其下游抑癌基因ARID1A(AT-rich interaction domain 1A)的表達從而促進卵巢癌的發生和發展[25]。

3 CASC15與其他腫瘤

3.1黑色素瘤 Yin等[26]的研究證實在黑色素瘤中CASC15呈上調表達且與腫瘤病理分級密切相關，利用siRNA外源性沉默腫瘤細胞內CASC15表達后腫瘤細胞的增殖和侵襲受到抑制，同時阻滯更多細胞停滯于G0/G1期并誘導凋亡發生。隨后該研究團隊利用RIP(RNA binding protein immunoprecipitation)檢測發現，黑色素瘤細胞內CASC15能夠直接與EZH2和H3K27me3結合；進一步的機制研究證實，CASC15通過在PDCD4(programmed cell death 4)啟動子區域募集EZH2并提高其H3K27的基化修飾水平從而在轉錄水平借助表觀遺傳機制下調抑癌基因PDCD4的表達，而反向調控PDCD4的表達能夠在一定程度上抑制CASC15的促增殖作用。后續實驗中也發現CASC15在黑色素瘤中的表達與Breslow厚度密切相關；外源性沉默CASC15能夠抑制β-catenin表達從而阻滯Wnt/β-catenin信號通路，低表達的β-catenin可以下調抗凋亡蛋白Survivin和Bcl-2并上調細胞凋亡標志物Bax來抑制腫瘤的增殖并促進細胞凋亡，同時利用shRNA下調CASC15的表達后EMT進程受到抑制導致腫瘤的遷移和侵襲能力降低[27]。另有研究發現CASC15基因在轉移性黑色素瘤中轉錄水平上升；其對美國癌癥聯合委員會淋巴結轉移Ⅲ期黑色素瘤141例進行臨床數據分析證實，CASC15可作為黑色素瘤復發及預后的獨立危險因素，同時在小鼠異種移植模型中高表達的CASC15與腫瘤顱內轉移密切相關。有體外細胞實驗利用siRNA敲低CASC15表達水平后發現CASC15可以通過上調31個增殖特異性基因(包括轉錄因子MITF和SOX10)以及抑制21個侵襲特異性基因表達來調控黑色素瘤增殖和侵襲狀態之間的表型轉換[28]。

3.2肺癌 肺癌患者中CASC15表達明顯上調且預示著更差的預后；同時miR-766-5p與CASC15表達呈負相關[29]。有體外細胞和體內動物實驗結果顯示下調CASC15的表達能夠抑制肺癌細胞增殖和遷移、侵襲，使用miR-766-5p抑制劑則可通過提高促癌基因KLK12(kallikrein related peptidase 12)的表達部分逆轉這一結果[29]。Li等[30]的研究證實在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)組織和細胞中CASC15表達升高，腫瘤組織內高表達的CASC15與腫瘤大小、淋巴結轉移及TNM分期密切相關；多因素分析結果表明CASC15是影響肺癌患者預后的獨立危險因素。此外，外源性沉默CASC15的表達后NSCLC細胞的增殖和遷移、侵襲受到抑制；Western Blot和免疫組織化學檢查結果顯示CASC15低表達時E-cadherin表達增高而N-cadherin和Vimentin表達降低，這提示CASC15通過調控EMT進程促進NSCLC的發生發展。Yu等[31]進一步研究發現在NSCLC中CASC15具有直接靶點miR-130b-3p；裸鼠皮下成瘤實驗中下調CASC15后腫瘤的生長和轉移都受到抑制且腫瘤中miR-130b-3p的表達增高，提示CASC15通過海綿吸附miR-130b-3p促進NSCLC的惡性生物學行為。

3.3乳腺癌 相比于正常乳腺組織和細胞，乳腺癌組織和細胞內CASC15呈異常高表達；體外細胞實驗發現敲低CASC15的表達能夠抑制腫瘤的增殖和侵襲等惡性行為[32]。進一步的機制研究結果表明，CASC15可以作為競爭性內源RNA(ceRNA)競爭性抑制miR-153-3p,且miR-153-3p與下游靶基因KLF5(kruppel like factor 5)mRNA 3'-UTR間存在結合位點，而下調miR-153-3p能夠部分逆轉CASC15 siRNA對KLF5表達的抑制作用，即CASC15通過內源性海綿吸附miR-153-3p來上調促癌基因KLF5的表達。此外，KLF5作為轉錄因子還可通過結合CASC15的啟動子來激活其轉錄進而上調其表達。上述實驗結果表明，KLF5/CASC15/miR-153-3p/KLF5能夠形成正反饋環來加速乳腺癌的發生和發展[32]。

3.4鱗狀細胞癌 Zuo等[33]的研究表明舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)中CASC15的表達增高而miR-33a-5p的表達降低,且二者表達水平呈負相關,高表達CASC15或低表達miR-33a-5p均可促進腫瘤的增殖和遷移、上調Cyclin D1表達，同時促使S期細胞比例增加。進一步實驗發現CASC15能夠促進促癌基因ZEB1的表達，而miR-33a-5p能夠在一定程度上消除過表達CASC15的促腫瘤作用。Wu等[34]同樣發現在TSCC中CASC15異常高表達并與miR-124表達呈負相關，而在癌旁正常組織中二者表達水平無明顯相關性；上調CASC15的表達能夠促進腫瘤的遷移和侵襲，過表達miR-214則具有相反的效果，同時miR-214能部分逆轉CASC15對腫瘤惡性生物學行為的促進作用。Zhang等[35]發現相比于口腔潰瘍患者和健康體檢者，口腔鱗狀細胞癌Ⅰ期和Ⅱ期患者血漿中CASC15表達上調，并且受試者工作特征曲線分析結果證實CASC15可以作為診斷口腔鱗狀細胞癌的依據。進一步的定量檢測發現CASC15與MEG3(maternally expressed 3)的表達呈負相關；過表達CASC15可以抑制MEG3的表達，這提示CASC15作為MEG3的上游抑制劑發揮作用。此外，上調CASC15能夠促進口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖，過表達MEG3可以部分減弱CASC15的影響。

3.5神經母細胞瘤 有研究發現低水平表達短CASC15亞型(CASC15-S)組的神經母細胞瘤病程進展較快且整體生存時間較短；在人神經母細胞瘤細胞內敲低CASC15-S的表達能夠提高細胞增殖和遷移能力[36]。此外，有基因表達分析結果提示神經母細胞瘤特異性標志物下降會伴隨CASC15-S下調和細胞黏附、細胞外基質轉錄物增加。上述研究結果表明，CASC15-S是神經生長和分化的介質并能夠影響神經母細胞瘤的發生和發展[36]。此外，有研究證實，在膠質瘤、視網膜母細胞瘤和骨肉瘤中，CASC15異常表達并調控腫瘤增殖和遷移、侵襲等諸多惡性生物學行為[37-39]。

綜上所述，lncRNAs在多種惡性腫瘤中表達失調并參與介導腫瘤的整個疾病進程。CASC15在腫瘤發生和發展中起重要作用，通過多種機制調控腫瘤的惡性生物學行為并與腫瘤分期和患者預后等臨床病理學特征密切相關。目前，對CASC15的研究還處在腫瘤內功能分析的初始階段，關于腫瘤形成過程中深層面的調控機制尚不明確。相信隨著研究的不斷深入，CASC15的功能將會進一步被揭示并為腫瘤綜合治療提供新的理論依據和干預靶點。