活血祛濕藥對糖尿病性脂肪肝大鼠腸道菌群的影響*

徐定昌 羌 瑞 趙 瑩 許松云 時歆未 王雨秾△

1.上海中醫藥大學方劑學教研室 (上海， 201203) 2.上海中醫藥大學數理教研室

在肝臟疾病中，非酒精性脂肪肝(NAFLD)的發病在我國位居第二，NAFLD常合并有肥胖、高脂血癥、糖尿病等[1]。糖尿病合并脂肪肝的發病一般和胰島素抵抗有關[2]，脂肪組織胰島素抵抗會加重脂代謝異常[3]。近來有研究顯示腸道菌群及其代謝產物與糖代謝和脂代謝關系密切，其中厚壁菌門和擬桿菌門占絕大多數[4]。腸道菌群可與人體共同或單獨代謝中藥成分，中藥成分亦可以調節腸道菌群的平衡[5]。目前活血祛濕藥對腸道菌群的影響情況及其與機體代謝產物的關聯性并不清楚。本文通過對活血藥和祛濕藥分組實驗，以期明確活血祛濕藥對糖尿病性脂肪肝大鼠腸道菌群的影響和相關代謝產物的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡清潔級雄性Wistar大鼠60只，體重140～160 g，于維通利華公司購買，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心〔實驗動物使用許可證號：SYXK(滬)2014-0008〕，通過實驗動物福利與倫理審查(倫理編號：PZSHUTCM190614013)，自由進食飲水，12 h明暗交替照明，適應性普通飼料喂養1周。

1.2 藥物制備 丹參、荷葉各0.3 kg，土茯苓、徐長卿、絞股藍各0.7 kg，蜜麩炒蒼術0.2 kg，以上藥物均由上?？禈蛑兴庯嬈咎峁?批號分別為：180807、180615、180825、180516、180804、180906)。將中藥分為活血藥(丹參、荷葉、絞股藍)、祛濕藥(土茯苓、徐長卿、炒蒼術)、全方藥(丹參、荷葉、絞股藍、土茯苓、徐長卿、炒蒼術)，制作水煎液。鹽酸二甲雙胍片，北京京豐制藥集團生產(批號：180133，規格：0.25 g/片)。

1.3 儀器與試劑 熒光定量PCR儀(FTC-3000，美國安捷倫公司)，全自動生化儀(AU5800，貝克曼公司)，血糖儀(卓越金采，批號：200637，羅氏公司)，血糖試紙(批號：476746，羅氏公司)。鏈脲佐菌素(STZ)于Sigma公司購買(批號：WXBC6558V，規格：1 g，純度：98%)。

1.4 分組與造模 60只大鼠隨機平均分為6組(空白組、模型組、對照組、活血組、祛濕組、全方組)。除空白組大鼠外，其余5組大鼠均行糖尿病性脂肪肝造模：通過兩次腹腔注射較低劑量1%STZ溶液，誘導大鼠形成2型糖尿病。配置1%STZ溶液，依照體重計算注射量，腹腔注射，終濃度為30 mg/kg。于STZ注射后的第6天第2次給藥，并隔天取大鼠尾尖血檢測血糖。血糖大于16.7 mmol/L表明造模成功。

1.5 給藥方法 對照組大鼠給予二甲雙胍粉末混懸液灌胃，給藥量為6.67 ml/kg·d，給藥濃度為7.5 mg/ml。分別制備為濃度0.35、0.40、0.75 g/ml的活血藥、祛濕藥、活血祛濕藥水煎液，分別按9.43、9.75、4.40 ml/(kg·d)劑量給活血組、袪濕組、全方組大鼠灌胃，持續7周。

1.6 觀察指標 觀察大鼠行為、狀態及死亡情況；稱量體重；觀察肝臟形態；第48天，將大鼠置于代謝籠中，收集糞便，于-80℃冰箱保存，待GC-MS檢測腸道菌群及短鏈脂肪酸；第49天，取腹主動脈血。

1.7 各項指標檢測 ①采用貝克曼AU5800全自動生化儀檢測天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。②實時PCR定量檢測厚壁菌、擬桿菌：采用QIAamp DNA Stool Mini Kit 對樣本進行基因組抽提，提取質粒用Axygen plasmid miniprep Kit(Axygen公司)試劑盒，測定質粒濃度用Qubit 3.0(Life Biotech公司)。通過熒光定量方法對厚壁菌與擬桿菌進行定量檢測。所用引物及引物序列：厚壁菌928-Firm TGAAACTYAAAGGAATTGACG；1040FirmR ACCATGCACCACCTGTC。擬桿菌798cfbF CRAACAGGATTAGATACCCT；cfb967R GGTAAGGTTCCTCGCGTAT。qPCR反應采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara公司)。③GC-MS定量檢測短鏈脂肪酸實驗：取糞便100 mg，加100 μl 15%磷酸，再加50 μg/ml 的內標(異己酸)溶液100 μl和乙醚400 μl勻漿1 min，于4 ℃ 12 000 rpm 離心10 min，取上清液上機測試。GC-MS 檢測的頂空條件、氣相色譜條件、質譜條件等參數參照參考文獻[6]。

2 結果

2.1 各組大鼠體重情況 見圖1。在造模的第12天到第26天，全方組大鼠與模型組、對照組相比，體重增長速度顯著下降，差異有統計學意義(P=0.017、0.025)。

圖1 各組大鼠體重圖

2.2 各組大鼠生化指標檢測結果 見圖2。全方組大鼠ALT水平高于空白組大鼠，P=0.004；活血組大鼠AST水平高于空白組、模型組和對照組，P<0.05；全方組大鼠TG水平低于對照組，P=0.014 ；造模后各組大鼠TC與LDL水平均升高，P<0.05；全方組大鼠HDL水平較其余各組升高，且與祛濕組相比，差異具有統計學意義，P=0.045。

2.3 各組大鼠腸道菌群豐度檢測結果 對照組大鼠擬桿菌含量低于模型組大鼠，P=0.029；祛濕組大鼠擬桿菌含量高于對照組大鼠，P=0.014。各組厚壁菌含量無顯著差異，P>0.05。

2.4 各組大鼠菌群豐度與代謝產物及生化指標的相關性 見圖4?？瞻捉M大鼠中兩種腸道菌與異戊酸都呈負相關(r<0,P<0.01)，與乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸呈正相關(r>0,P<0.01)。模型組大鼠TC與HDL和LDL均呈正相關(r值分別為0.736和0.967,P<0.05)；厚壁菌與乙酸、丙酸、丁酸、戊酸呈負相關(r<0,P<0.01)，與異丁酸、異戊酸、己酸呈正相關(r>0,P<0.01)；擬桿菌與厚壁菌呈負相關(r=-0.949,P<0.01)。對照組大鼠兩種腸道菌與各短鏈脂肪酸呈正相關(r>0,P<0.01)，TC與兩種腸道菌及LDL均呈正相關(r>0,P<0.01)。

圖2 各組大鼠生化指標檢測結果(n=10)

圖3 各組大鼠腸道菌群豐度檢測結果(n=6)

圖4 各組大鼠菌群豐度與代謝產物及生化指標的相關性

3 討論

Hernández等[7]研究表明，結腸內代謝發酵的醋酸，對體重控制和體內乳糖穩態以及胰島素敏感性有較好的促進作用，丙酸是擬桿菌門發酵的主要產物，吸收后主要由肝臟代謝，并抑制膽固醇的合成[8]。丁酸可改善高脂飲食引起的體脂率升高和胰島素抵抗[9]。肥胖小鼠擬桿菌門數量減少，厚壁菌門數量增加[10]。這些研究表明腸道菌群和短鏈脂肪酸之間、短鏈脂肪酸和脂代謝之間存在密切聯系。因此我們測定了各組大鼠血清指標及腸道菌群豐度并進行相關性分析，實驗結果中模型組大鼠血清TC與LDL濃度升高，且兩種腸道菌與各短鏈脂肪酸相關性分布較空白組發生變化，表明造模使其短鏈脂肪酸及脂質代謝發生了異常。對照組大鼠兩種腸道菌與各短鏈脂肪酸的相關性分布接近空白組，且與TC表現出正相關。這與我們推測相符，提示藥物對于糖尿病性脂肪肝的改善作用可能通過改變擬桿菌和厚壁菌與短鏈脂肪酸的代謝關系從而影響TC代謝，達到治療目的。但這種通路的靶點位置有待進一步研究。

糖尿病性脂肪肝在中醫學中散見于“消渴”“積聚”“肝著”“脾癉”等病證中[11]。臨床多見患者屬痰瘀互結證、痰濕內阻證、肝郁氣滯證等證型[12]。其病機為脾胃運化失常，水濕內停，痰濕氣阻，濕阻氣機，日久阻礙血行，瘀在脅肋，形成本虛標實之證[13]。《素問·奇病論》中提到“治之以蘭，除陳氣也”為脾癉的治療原則，即可以使用芳香化濕、健脾化濕、清利濕熱之品[14]。臨床上常用丹參、荷葉、絞股藍活血化瘀，其中荷葉、絞股藍對肥胖癥、高脂血癥具有良好的預防和治療的

作用[15]。劉君穎等[16]研究表明化痰祛濕活血方具有減輕肝細胞脂肪沉積的作用。蒼術、徐長卿、土茯苓祛濕，柴胡、郁金、決明子、砂仁疏肝健脾。為明確活血祛濕中藥對糖尿病性脂肪肝大鼠腸道菌群的影響。我們測定了各組大鼠擬桿菌和厚壁菌豐度并進行比較，結果表明祛濕組大鼠擬桿菌豐度明顯高于對照組，而厚壁菌在各組大鼠間無明顯差異；全方組大鼠TG水平低于對照組；第2周至第4周全方組與對照組相比，體重增長速度顯著下降。提示活血祛濕藥在提高擬桿菌豐度及降低TG含量上優于二甲雙胍，這對于中藥聯合西藥治療糖尿病性脂肪肝，有較好的發掘前景。