骨碎補總黃酮對卵巢去勢大鼠骨質疏松的干預作用

陳學生 張洪欽 陳秋琴 林 立 王永勝，4▲

1.廈門大學附屬福州第二醫院輸血科，福建福州 350007；2.廈門大學附屬福州第二醫院藥劑科，福建福州 350007；3.廈門大學附屬福州第二醫院兒科，福建福州 350007；4.復旦大學附屬中山醫院廈門醫院藥劑科，福建廈門 361015

骨質疏松（OP）是嚴重威脅絕經后女性健康的重要因素。OP 是一種以骨量降低、骨微觀結構損壞及骨脆性增加等為特征的全身性骨骼疾病，且易導致骨折[1]。由于起病隱匿，早期無典型癥狀，后期多引發疼痛或骨折時才得以確診[2]。近年來OP 治療方法經驗不斷豐富，研究者也努力從具有治療作用的中藥中提取有效成分，深入分子作用通路機制研究[3-4]。目前已證實骨碎補對骨損傷、OP 等具有良好的防治作用，由于其成分多樣，主要有黃酮、三萜、酚酸及其苷類等，其有效成分尚不明確，因此深入研究骨碎補防治OP 有效成分的藥理作用具有重要意義。本研究通過制備卵巢摘除誘導OP 模型觀察骨碎補總黃酮對大鼠OP 的干預作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

強骨膠囊（含骨碎補總黃酮有效成分0.142 g，總黃酮含量≥80%，生產批號：181101，北京歧黃制藥有限公司）。大鼠血清骨轉化標志物骨鈣素（BGP）試劑盒（生產批號：20190222）、大鼠血清甲狀腺素（PTH）試劑盒（生產批號：20190318）、大鼠血清骨堿性磷酸酶（BALP）試劑盒（生產批號：20190318）。以上試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。包埋機（型號：BMJ-A，常州中威電子儀器），顯微鏡（型號：BA210T，麥克奧迪實業集團有限公司），雙能X 線骨密度儀（DXA）（型號：LUNAR-Prodigy，美國GE 公司）。

1.2 研究對象

選取50 只體重70～90 g 的3月齡無特定病原（SPF）級健康雌性斯普拉格-杜勒（SD）大鼠，購自于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[編號：SCXK（滬2007-0005）]。飼養環境保持通風換氣，氨濃度控制小于20 ppm，室內溫度控制18～29℃，相對濕度達40%～70%，空氣換氣次數10 次/h，氣流速度≤0.18 m/s。本研究動物實驗經福州市第二醫院實驗動物倫理委員會審核同意。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及造模 將其中的21 只SD 大鼠按照隨機數字表法分為三組：空白組、模型組、治療組（每組各7 只）。依次沿動物兩側軟肋下皮膚剪開，并分離出皮膚的筋膜和腹膜臟層，在暴露腹腔后隨后切除模型組和治療組大鼠雙側卵巢，分層縫合、消毒。空白組不做卵巢切除處理。

1.3.2 給藥及取材 術后普通飼養3 個月開始給藥。空白組和模型組給予蒸餾水灌胃。根據大鼠與人的體表面積比例擬定大鼠的骨碎補給藥劑量。治療組予0.054 g/（kg·d）骨碎補總黃酮灌胃。首次干預前進行骨密度（BMD）檢測，隨后連續灌胃給藥3 個月，取材前再次檢測BMD。取材前絕對禁食24 h，用10%水合氯醛給予0.3 mL/100 g 體重劑量肌內注射深度麻醉，抽取腹主動脈血5 mL，3000 r/min 離心5 min，分離血清，-20℃保存待用。抽血完畢依次分離附著股骨干骺端的肌肉和解體組織，暴露其股骨頭，用潔凈咬骨鉗將其鉗碎，用無菌EP 管收集并標記。

1.3.3 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中BGP、BALP、PTH 參照ELISA 檢測試劑盒的操作說明書，在450 nm 波長下使用酶標儀測量相應吸光度值，繪制其標準曲線，計算各組BGP、BALP、PTH 水平，計算樣品實際濃度。

1.3.4 BMD 檢測 10%水合氯醛對大鼠深度麻醉后，大鼠正位放置定位板，四肢伸展。應用DXA 系統采用小動物模式掃描，測量各組大鼠左側股骨BMD。

1.3.5 蘇木精-伊紅（HE）染色 大鼠股骨組織剪碎約3 mm，4℃下在4%多聚甲醛液（pH=7.4）中固定48 h。使用10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）（pH=7.4）在4℃條件下脫鈣1 個月，脫鈣液每周更換1 次。脫鈣結束，石蠟包埋連續切片。切片的厚度約4 μm，置65℃的恒溫烘箱中烤6 h。將組織切片常規脫蠟染色制片。光學顯微鏡下觀察HE 染色情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，任意兩組比較采用LSD-t 檢驗，組內比較采用配對t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠干預后BMD 的比較

干預前，模型組的BMD 低于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組的BMD 與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。干預后，空白組和治療組的BMD 高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組的BMD 低于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）。三組干預前后組內的BMD 比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1、圖1）。

表1 三組大鼠干預后BMD 的比較（mg/cm2，±s）

表1 三組大鼠干預后BMD 的比較（mg/cm2，±s）

與模型組同期比較，*P＜0.05；與空白組同期比較，#P＜0.05

組別 只數 干預前 干預后 t 值 P 值空白組模型組治療組777 0.477±0.005*0.369±0.013 0.364±0.018#0.481±0.007*0.358±0.011 0.386±0.005*#2.236 2.051 2.698 0.089 0.110 0.054

2.2 三組大鼠骨轉化生物標志物水平的比較

模型組的BGP 低于空白組，BALP、PTH 高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組的BGP 低于空白組，BALP、PTH 高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組的BGP 高于模型組，BALP、PTH低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 三組大鼠骨轉化生物標志物水平的比較（±s）

表2 三組大鼠骨轉化生物標志物水平的比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數 BGP（μg/L） BALP（IU/L） PTH（pmol/L）空白組模型組治療組777 1.79±0.14 0.68±0.14*1.45±0.22*#100.79±11.69 192.73±24.23*139.45±11.91*#28.16±1.27 49.78±3.22*39.92±4.64*#

2.3 三組大鼠的股骨組織病理學情況

空白組大鼠的股骨組織形態結構較為完整，大鼠股骨干骺端骨小梁連接致密，網狀結構完整。與空白組相比，模型組骨小梁數目減少，骨小梁間連接稀疏間距變大，網狀結構被破壞嚴重，骨髓腔融合較嚴重。相比模型組，治療組骨小梁微結構有一定程度的改善，骨小梁數量增多，其連接點也見增多（圖2，封三）。

3 討論

絕經后OP 為高轉換型OP，即骨吸收與骨形成都比較活躍，但以骨吸收為主。絕經后OP 主要表現為骨量迅速丟失，骨折多以股骨上端為主[5]。不同部位骨骼的骨質成分不同，皮質骨或密質骨構成長骨骨干和所有骨的外層，而小梁骨或松質骨構成骨骼的內層[6]。婦女絕經后由于卵巢功能衰退，導致機體雌激素水平下降，繼發甲狀旁腺功能亢進，甲狀旁腺激素分泌增多，而降鈣素分泌不足，骨重建單位進行負平衡活動，骨吸收大于骨形成[7-8]。小梁骨在絕經早期迅速丟失致骨折風險增加，皮質骨丟失較緩慢，但較持續，隨著小梁骨和皮質骨的丟失，髖部的骨折風險增加[9]。

骨碎補的主要生物活性成分為黃酮類化合物，因其潛在的藥用價值而備受關注，在基礎及臨床研究中廣泛應用[10]。以往實驗已證實骨碎補對卵巢切除所致的骨高轉換有明顯的抑制效應，骨碎補能抑制破骨細胞的生長，不僅對破骨母細胞向成熟破骨細胞轉化有抑制作用，而且對破骨細胞性骨吸收有抑制作用[11-13]。DXA 測量髖部、全身是目前最常用、成熟的測量方法，具有較好的重復性、輻射量低等優點，DXA 的BMD結果與骨折風險相關性已被廣泛認可，是多數臨床藥物研究療效觀察采用的測量方法[14]。本研究通過對比骨碎補總黃酮干預前后各組間BMD 變化，結果提示，模型組和給藥組干預前的BMD 比較，差異無統計學意義（P>0.05）；干預后，治療組骨量丟失情況較OP 模型組有所改善。HE 染色鏡下可見治療組骨小梁微結構有所改善，骨小梁數量和連接點相應增多。

目前骨轉換生化標志物已廣泛應用于臨床診療、研究中，骨形成標志物有BGP、BALP 等，骨吸收指標包括PTH 和性激素等[15-16]。血清中的BGP 在骨吸收或形成能力增強時會增加，具有較強的敏感性和特異性。BALP 在骨組織中較為活躍，因此發生OP 時，BALP 亦可上升[17]。骨碎補總黃酮具有促進骨形成標志物BGP、BALP 水平與活性，并抑制骨吸收標志物PTH 水平。骨轉換生化標志物雖不能完全作為OP診斷的金標準，但結合BMD，可較早地獲悉骨轉換動態，因此在監測抗OP 的治療效果等方面具有重要作用[18-19]。

綜上所述，對去勢誘導的OP 給予骨碎補有效成分總黃酮干預具有良好的改善作用，對今后在藥品開發和臨床實際應用中具有重要的指導意義。

圖2 大鼠股骨組織病理圖（HE 染色，400×）（見內文第6頁）