IL-17信號通路在回歸熱神經性疏螺旋體病中的作用

程美慧 陸 巍 張 靜 丁開云 劉紅旗

中國醫學科學院 北京協和醫學院醫學生物學研究所感染和免疫實驗室，云南昆明 650118

回歸熱神經性疏螺旋體病（relapsing fever neuroborreliosis，RFNB）是由回歸熱疏螺旋體感染引起的一種中樞神經系統疾病綜合征[1]，這種感染的特征是使患者反復出現高熱和菌血癥，甚至出現中樞神經系統疾病[2-4]。前期研究發現[5]，回歸熱疏螺旋體感染后，小鼠中樞神經系統癥狀的出現與T淋巴細胞有關，但是確切的致病機制還不清楚。

白細胞介素（IL）-17是T細胞和先天免疫細胞分泌的細胞因子[6-8]。IL-17細胞因子家族包括IL-17A～F 6個細胞因子[9-10]，其中IL-17A為該家族的主要成員，參與了多種感染與免疫相關疾病[11-13]。研究顯示[14]，IL-17可誘導實驗性變態反應性腦脊髓炎中樞神經系統疾病的產生。另外，萊姆病螺旋體感染引起的萊姆病可通過抑制IL-17來預防關節炎的發生[15-18]。但是，IL-17信號通路是否與RFNB的發生有關目前鮮見相關研究。

前期研究發現C57BL/6小鼠是研究RFNB最理想的小鼠模型[19]。另外，DAH菌株由于能在免疫正常的小鼠體內快速復制，因此被廣泛地用于動物模型研究[5]。本研究在前期研究的基礎上，探索IL-17信號通路在回歸熱疏螺旋體感染誘導的中樞神經系統疾病中的作用，以期為該病的治療提供一定的理論基礎和指導。

1 材料與方法

1.1 菌種

回歸熱疏螺旋體DAH株由美國托馬斯杰斐遜大學醫學院根據美國國立衛生研究院的協議饋贈。

1.2 實驗動物

C57BL/6野生型小鼠共14只，雌雄各半，由中國醫學科學院醫學生物學研究所小實驗動物部提供，實驗動物生產許可證SCXK（滇）K2014-0002。IL-17信號通路缺陷（IL-17-/-）小鼠（C57BL/6背景）共8只，雌雄各半，來源于日本東京理工大學生物醫學研究所動物疾病模型中心。所有小鼠均為健康8～12周齡清潔級小鼠，體重18～22 g。于室溫（20～25℃）條件下飼養，標準鼠食，自由飲水。

1.3 主要儀器和試劑

BSK-H培養基（貨號：B8291）購于美國Sigma公司；10%中性福爾馬林固定液（貨號：E672001）購于BBI Life Sciences公司；DPBS（貨號：SH30028.02）購于HyClone公司；IgG酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號：E90-131-38）和IgM ELISA試劑盒（批號：E90-101-33）均購于Bethyl公司；酶標儀購于TECAN公司；暗視野顯微鏡購于Nikon公司；3DHISTECH數字切片掃描儀；抗凝劑（1× ACD溶液）由感染和免疫實驗室制備。

1.4 方法

1.4.1 實驗動物分組 8只IL-17-/-小鼠為IL-17-/-組；將14只C57BL/6野生型小鼠隨機分為兩組，第一組（S組）為6只，作為前期觀察，實驗結束后進行安樂死；第二組（E組）為8只，作為IL-17-/-組的對照，感染后第14天解剖，取脾臟和脊髓做病理分析。

1.4.2 實驗動物感染 將螺旋體用BSK-H培養基稀釋成5個/HPF，用1 mL注射器吸取200 mL螺旋體通過腹腔注射感染小鼠。

1.4.3 血液樣品的采集和處理 感染前后，每天采小鼠尾靜脈血5 μL，用45 μL 1×ACD抗凝劑稀釋后，吸取5 μL置于載玻片上，通過暗視野顯微鏡觀察并記錄血液內菌體數量，之后將血液樣品保存于-80℃冰箱。

1.4.4 小鼠血液內螺旋體特異性IgG和IgM含量測定從-80℃冰箱內取出“1.4.3”中保存的血液樣品，采用雙抗體夾心ELISA法測定小鼠血液內IgG和IgM的含量，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。每組設2個復孔，實驗重復3次。

1.4.5 神經癥狀觀察 每天對感染回歸熱疏螺旋體小鼠的中樞神經系統疾病癥狀評分[20]：“0”為無明顯神經癥狀；“1”為尾巴無力或一后肢無力；“2”為雙后肢無力；“3”為一后肢麻痹；“4”為雙后肢麻痹；“5”為因神經疾病引起死亡。

1.4.6 組織病理學分析 在回歸熱疏螺旋體感染后第14天用CO2麻醉E組和IL-17-/-組小鼠，用DPBS進行心臟透析后解剖小鼠，取出脊髓，用10%中性福爾馬林固定液固定后進行包埋、切片和蘇木精-伊紅（HE）染色，之后用3DHISTECH數字切片掃描儀進行切片掃描。

1.5 統計學方法

采用GraphPad Prism 8統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 回歸熱疏螺旋體感染S組小鼠血液中螺旋體數、特異性抗體發生情況及神經系統發病情況

用回歸熱疏螺旋體DAH菌株感染S組小鼠，發現小鼠體內有效地復制擴增并引起菌血癥（圖1A），產生螺旋體特異性IgG和IgM（圖1B）。用回歸熱疏螺旋體DAH菌株感染S組小鼠，從感染后第8天開始，小鼠開始出現尾巴無力、后肢無力和癱瘓等中樞神經系統疾病癥狀，之后疾病呈現漸進性的發展，發病率達到100%，見圖2。綜合上述結果選取感染14 d為實驗觀察時間。

圖1 回歸熱疏螺旋體感染S組小鼠血液中螺旋體數和特異性抗體發生情況

圖2 回歸熱疏螺旋體感染S組小鼠中樞神經系統癥狀發生情況

2.2 回歸熱疏螺旋體感染E組和IL-17-/-組小鼠血液中螺旋體數和特異性抗體發生情況

用回歸熱疏螺旋體DAH菌株感染E組和IL-17-/-組小鼠后發現，E組和IL-17-/-組小鼠體內的菌血癥變化水平基本一致，見圖3A。此外，回歸熱疏螺旋體均能誘導E組和IL-17-/-組小鼠螺旋體特異性IgG和IgM產生，見圖3B。

圖3 回歸熱疏螺旋體感染E組和IL-17-/-組小鼠血液中螺旋體數和特異性抗體發生情況

2.3 回歸熱疏螺旋體感染E組和IL-17-/-組小鼠中樞神經系統癥狀評分比較

感染9-14 d，IL-17-/-組感染回歸熱疏螺旋體后的中樞神經系統疾病評分低于E組，差異有統計學意義（P ＜0.05或P ＜0.01），見圖4。此外，IL-17-/-組小鼠脊髓組織中小膠質細胞的數量少于E組小鼠，見圖5。

圖4 回歸熱疏螺旋體感染E組和IL-17-/-組小鼠中樞神經系統癥狀評分比較

圖5 回歸熱疏螺旋體感染引起E組和IL-17-/-組小鼠組織內的炎性浸潤情況（HE染色）

3 討論

回歸熱疏螺旋體感染能引起包括中樞神經系統疾病在內的多系統疾病[1]。在前期研究中已發現回歸熱疏螺旋體感染免疫正常的小鼠誘導的中樞神經系統疾病癥狀與T淋巴細胞有關[5]，被激活的T淋巴細胞可能通過分泌多種炎性細胞因子參與致病過程[21-22]。

本研究發現，盡管回歸熱疏螺旋體在IL-17-/-小鼠與C57BL/6野生型小鼠體內均能有效復制，但是與野生型小鼠比較，IL-17-/-小鼠的炎癥和神經癥狀顯著減輕，提示IL-17信號通路在RFNB中具有重要作用。最近研究發現[23-25]，IL-17信號通路的激活可能與m-TOR信號通路有關，需進一步探索RFNB中m-TOR信號通路和IL-17信號通路激活的聯系，這對于闡明回歸熱疏螺旋體感染導致的中樞神經系統疾病的致病機制至關重要。