基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接探討清熱卡森顆粒治療腎性水腫的分子機制

段艷芬 張東寧 侯帥紅 莫國艷 韓林濤 黃 芳 尹 強, 李晶晶

1.湖北中醫(yī)藥大學藥學院，湖北武漢 430065；2.新疆維吾爾藥業(yè)有限責任公司，新疆烏魯木齊 830026；3.湖北中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，湖北武漢 430065

清熱卡森顆粒是由菊苣加工制成的單味制劑，其具有利尿、消水腫的作用，用于治療濕熱黃疸、胃痛食少、水腫少尿等癥狀，菊苣同時具有潤腸通便、健胃、利尿和促進傷口愈合效果[1-3]。腎性水腫常由腎病綜合征、急性和慢性腎炎、急性和慢性腎功能不全等腎疾病引起，首先發(fā)生在機體松散組織，進而發(fā)展至腳踝和下肢，直至全身，甚至腹水[4]。該病易復發(fā)，可導致蛋白尿、血尿、高血壓病等系統(tǒng)損傷[5]，一般使用西藥利尿劑治療，但一些特發(fā)性水腫患者長期服用利尿劑呋塞米反而會增加水腫，即出現(xiàn)藥物誘導性水腫[6]。因此探索新的利尿藥物尤為重要，菊苣利水消腫的作用在維吾爾族醫(yī)學中應用廣泛，但其治療腎性水腫的作用機制和靶點尚不清楚。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法和分子對接技術(shù)探討清熱卡森顆粒治療腎性水腫可能的作用機制，為腎性水腫的治療研究提供新思路。網(wǎng)絡(luò)藥理學打破以往單組分、單靶點的概念[7]。分子對接常用于藥理研究中探索新的疾病治療靶點。本研究采用SwissADME中的參數(shù)對清熱卡森顆粒的化學成分進行篩選，利用分子對接技術(shù)揭示清熱卡森顆粒的有效成分與腎性水腫的治療靶基因復雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，解釋清熱卡森顆粒的多組分、多靶點、多路徑的作用機制[8-10]。

1 資料與方法

1.1 清熱卡森顆粒活性成分篩選

從中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）[11]和相關(guān)文獻[12-13]中查找清熱卡森顆粒化學成分，采用PubChem數(shù)據(jù)庫搜索成分，保存SMILES結(jié)構(gòu)。導入SwissADME中得到藥物的相關(guān)參數(shù)，其中GI absorption代表胃腸道吸收和大腦進入，是兩種藥代動力學行為，在藥物發(fā)現(xiàn)過程的不同階段其對藥物評估至關(guān)重要[14]。Lipinski規(guī)則可以比較準確地預測化合物的吸收或滲透性能，其中有關(guān)親脂性的規(guī)則可以評估類藥性[15-16]。本研究以GI absorption=High、Lipinski規(guī)則違反次數(shù)≤0為條件參數(shù)篩選得到其有效成分。

1.2 清熱卡森顆粒化合物靶點篩選

根據(jù)Swiss數(shù)據(jù)庫，選取結(jié)果中probability ＞0的靶標進行分析。

1.3 清熱卡森顆粒治療腎性水腫靶點篩選及其網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在疾病數(shù)據(jù)庫GeneCards、Malacards、OMIM中，通過關(guān)鍵詞“Renal edema”合并去重后獲得疾病靶點。

1.4 基因功能與途徑分析

運用R語言進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析清熱卡森顆粒治療腎性水腫的作用機制。以P ＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 活性成分-靶點基因-富集通路網(wǎng)絡(luò)圖

將活性成分、靶點基因和富集通路導入Cytoscape 3.7.0軟件，構(gòu)建三者的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對接驗證

利用Cytoscape 3.7.0中CentiScape插件計算度值（Degree），選取Degree排名前10位的靶點與化合物，分別利用AutoDockTools 1.5.6進行分子對接驗證。采用PyMOL軟件對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性成分進行修飾，在相同條件下進行分子對接實驗，獲得可能與靶蛋白結(jié)合并發(fā)揮藥理作用的有效成分。一般認為，分子對接結(jié)合能的絕對值＞4.25說明具有一定的結(jié)合活性，對接結(jié)合能絕對值＞5.0說明結(jié)合活性較好，對接結(jié)合能絕對值＞7.0說明具有很強烈的結(jié)合活性[17-18]。

2 結(jié)果

2.1 清熱卡森顆粒活性成分篩選

結(jié)合數(shù)據(jù)庫與文獻檢索初步篩選出35個活性成分。SwissADME篩選結(jié)果表明這35種化合物在體內(nèi)效果較好，主要為黃酮類、萜類、苯丙素類等。35種化合物過濾條件的SwissADME參數(shù)見表1。

表1 清熱卡森顆粒活性成分基本信息

2.2 潛在目標篩選

在疾病數(shù)據(jù)庫中合并去重后獲得1397個與疾病有關(guān)的基因，其中有153個治療腎性水腫的潛在靶基因。

2.3 基因功能與途徑分析

利用R語言3.6.1和Bioconductor等數(shù)據(jù)包提取信息，設(shè)定閾值P ＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05，GO富集分析結(jié)果見圖1（封三）。KEGG途徑注釋顯示，153個潛在靶基因中有150個（98.0%）富集，涉及155條途徑，基因顯著富集在PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路等。見圖2（封三）。

圖1 清熱卡森顆粒治療腎性水腫的GO富集

圖2 清熱卡森顆粒治療腎性水腫的KEGG通路富集

2.4 化合物-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

將篩選得到的35個活性成分、153個靶點基因和KEGG通路分析的前12條相關(guān)途徑導入Cytoscape 3.7.0軟件中構(gòu)建活性成分-靶點基因-富集通路網(wǎng)絡(luò)圖，圖中共有200個節(jié)點（活性成分35個，靶點153個，通路12個）。圖中最外圈圓形代表通路，最內(nèi)圈的圓形代表活性成分，其他代表靶點。見圖3。

圖3 活性成分-靶基因-富集途徑網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 分子對接驗證

根據(jù)Degree排名前10的靶點有EGFR、KDR、MAPK3、IGF1R、AKT1、GSK3B、MAPK1、PRKCA、SRC、MMP9。排名前8的化合物有毒扁豆胺堿、木蘭素A、山萵苣素、秦皮乙素、11β，13-二氫山萵苣素、良姜素、槲皮素、11β，13-二氫山萵苣苦素。靶點與化合物的分子對接結(jié)合能打分的絕對值結(jié)果顯示，篩選得到的活性成分與靶點的對接結(jié)合能均具有較好的活性。見圖4（封四）。

圖4 核心靶點與化合物的分子對接結(jié)合能打分熱圖

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)菊苣即清熱卡森顆粒中萜類化合物活性最強，其次是黃酮類化合物，其活性成分山萵苣素、秦皮乙素、槲皮素等富集程度較高。根據(jù)Degree值可知EGFR、KDR、MAPK3、IGF1R、AKT1、GSK3B等為清熱卡森顆粒治療腎性水腫的重要靶點。有研究表明菊苣包含苦味物質(zhì)秦皮乙素，具有鎮(zhèn)痛、利尿、促進尿酸排泄的作用[19]。山萵苣苦素在菊苣中含量較高，特異性強，其保肝作用主要與倍半萜內(nèi)酯成分有關(guān)，且具有抗瘧疾的作用[20]。Weso?owska等[21]研究報道，前列腺素E2（PEG2）能增強疼痛反應和水腫，而8-去氧山萵苣素、山萵苣素、山萵苣苦素等化合物可使PEG2減少，減輕水腫。黃酮類化合物槲皮素、木犀草素屬于黃嘌呤氧化酶抑制劑的非嘌呤類似物[22]。有文獻研究[23]提示，槲皮素可能是潛在的預防炎癥性腎損傷的治療物質(zhì)，此外，槲皮素能抑制M2巨噬細胞的極化，從而減少腎纖維化。通過KEEG富集分析發(fā)現(xiàn)，清熱卡森顆粒治療腎性水腫的作用主要與PI3K-Akt、MAPK、Ras、Rap1等信號通路密切相關(guān)。其中PI3K-Akt靶基因數(shù)目最多，PI3K-Akt信號通路在腎纖維化的過程中起重要作用，還參與降低腎細胞外基質(zhì)的堆積，以及抑制腎惡性腫瘤患者病情的惡化[24-25]。MAPK等信號通路，如細胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑等是參與腎纖維化的重要信號通路[26]。Ras及Rap1信號通路能夠介導腎小球炎癥損傷[27-28]。Rap1信號通路與腎纖維化靶標相關(guān)的數(shù)量較多，具有多種合作途徑，能夠調(diào)節(jié)腎纖維化的進程，參與細胞凋亡和炎癥等[29]。本研究在分子對接過程中，選取排名靠前的8個有效成分化合物與核心靶蛋白進行對接，結(jié)合能均為負值，提示模型對接效果好，進而證明網(wǎng)絡(luò)藥理學預測結(jié)果可靠、準確。清熱卡森顆粒可能通過EGFR、KDR、MAPK3、IGF1R、AKT1、GSK3B等靶點來干預腎性水腫及其并發(fā)的炎癥反應，預防炎癥性腎損傷，減少腎纖維化，維系腎臟濾過屏障。本研究仍具有一定的局限性，如探究清熱卡森顆粒治療腎性水腫的詳細作用后期需進一步對菊苣潛在活性成分、作用靶點及通路進行免疫印跡試驗和PCR技術(shù)等實驗驗證。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接，提示清熱卡森顆粒可通過多成分、多靶點、多通路的形式來治療腎性水腫，為臨床研究提供依據(jù)。