國醫(yī)大師呂仁和教授治療糖尿病腎病核心藥物組合及作用機(jī)制研究

車 彪 邵 凡 王世東 陳小愚 李 娜 李瀟然 唐 誠

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院腎病內(nèi)分泌2區(qū)，北京 100700；2.生命奇點(diǎn)科技有限公司，北京 100089

糖尿病腎病是臨床常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，據(jù)統(tǒng)計(jì),我國30%～50%的糖尿病患者合并有糖尿病腎病[1]。國醫(yī)大師呂仁和教授師從施今墨、秦伯未、祝諶予等中醫(yī)名家，在防治糖尿病腎病方面取得了突出成就，提出了糖尿病腎病“微型癥瘕”病機(jī)及散結(jié)消聚治法。本研究通過對(duì)呂仁和教授門診治療糖尿病腎病患者病例進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，試對(duì)呂仁和教授治療糖尿病腎病核心藥物組合及其藥理學(xué)作用機(jī)制進(jìn)行研究，以揭示其科學(xué)內(nèi)涵。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集2018年1月—2019年4月于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院呂仁和教授門診就診的糖尿病腎病患者的病案。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合2015年《中國成人糖尿病腎病診治的專家共識(shí)》[2]制訂的糖尿病腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)。②患者基本信息、癥狀、處方記錄完整。③由專家親自開具處方，處方有專家簽名。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①專家簽字處方中屬于轉(zhuǎn)抄其他醫(yī)師處方者，或非患者本人就診者。②未服用中藥湯藥治療的患者。

1.4 醫(yī)案數(shù)據(jù)庫建立及醫(yī)案數(shù)據(jù)處理

根據(jù)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)及納排標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出334例糖尿病腎病患者病案。由雙人將334例次處方標(biāo)準(zhǔn)化錄入Microsoft office Excel 2016軟件，建立呂仁和教授診治糖尿病腎病醫(yī)案數(shù)據(jù)庫，并對(duì)雙錄入數(shù)據(jù)進(jìn)行核查。藥物名稱參考《中華人民共和國藥典》[3]及全國中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十三五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》[4]等進(jìn)行中藥的標(biāo)準(zhǔn)化處理，如“赤白芍”改為“赤芍”“白芍”等。

1.5 數(shù)據(jù)挖掘

應(yīng)用R軟件對(duì)334例次處方進(jìn)行藥物頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，篩選出處方中常用中藥。應(yīng)用R軟件arules包中Apriori算法對(duì)334例次處方中的藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)置相關(guān)參數(shù)篩選出處方中關(guān)聯(lián)性強(qiáng)的核心藥物組合。Apriori算法相關(guān)參數(shù)設(shè)置：最小支持度（support）為0.3，最小置信度（confidence）為0.9，最小提升度（lift）為1。

1.6 核心藥物組合作用機(jī)制分析

1.6.1 核心藥物組合化合物篩選及靶點(diǎn)預(yù)測 以數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果中核心藥物組合為研究對(duì)象，通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP）[5]進(jìn)行化合物的查詢及篩選，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料對(duì)化合物進(jìn)行補(bǔ)充[6-8]。選取口服利用度（oral bioavailability，OB）及類藥性（drug-likeness，DL）作為篩選指標(biāo)，篩選OB≥30%且DL≥0.18的化合物作為候選化合物[9]。篩選結(jié)束后，在PubChem數(shù)據(jù)庫[10]中查詢化合物相應(yīng)的SMILE號(hào)，將SMILE號(hào)導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[11]進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測。根據(jù)Unitprot數(shù)據(jù)庫[12]中相應(yīng)的靶點(diǎn)基因名，對(duì)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.6.2 糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以“diabetic kidney disease”“diabetic nephropathy”等為關(guān)鍵詞，篩選GeneCards數(shù)據(jù)庫[13]、TTD數(shù)據(jù)庫[14]、DrugBank數(shù)據(jù)庫[15]、Disgenet數(shù)據(jù)庫[16]中糖尿病腎病的相關(guān)靶點(diǎn)。對(duì)4個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫中的靶點(diǎn)進(jìn)行合并、去重，作為疾病的候選靶點(diǎn)。根據(jù)Unitprot數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的靶點(diǎn)基因名，對(duì)候選靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.6.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及篩選關(guān)鍵靶點(diǎn) 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的化合物相關(guān)靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)取交集，將交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫[17]中，繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件對(duì)所得PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯冗x取各節(jié)點(diǎn)連接度的2倍中位數(shù)值為最小閾值進(jìn)行初次篩選，再選擇篩選后網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的介度的中位數(shù)值及緊密度的中位數(shù)值為最低閾值，對(duì)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次篩選。通過拓?fù)鋮?shù)二次篩選后的靶點(diǎn)，其相互作用關(guān)系更緊密，傳遞的信息及影響的節(jié)點(diǎn)更多，為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6.4 富集分析 將以上所得的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)[18]，并進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析。應(yīng)用R語言對(duì)富集分析中生物過程、分子功能和細(xì)胞組成成分、生物學(xué)通路4類主要數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.6.5 構(gòu)建核心藥物組合作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖 應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件對(duì)核心藥物組合的化合物及對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)、關(guān)鍵靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的生物學(xué)通路構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘

呂仁和教授334例次處方中共包含163味中藥（3769次），對(duì)其進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，按藥物頻次由高到低進(jìn)行排序，前10味依次為：丹參（294次，7.80%）、赤芍（229次，6.08%）、牡丹皮（223次，5.92%）、太子參（186次，4.94%）、豬苓（184次，4.88%）、黃芪（128次，3.40%）、川芎（126次，3.34%）、澤蘭（115次，3.05%）、茯苓（107次，2.84%）、當(dāng)歸（104次，2.76%）。對(duì)163味中藥進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則15條（表1）。綜合頻數(shù)統(tǒng)計(jì)及關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果，丹參、赤芍、牡丹皮均出現(xiàn)在頻數(shù)統(tǒng)計(jì)及關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果前3位，為呂仁和教授治療糖尿病腎病的核心藥物組合。

表1 呂仁和教授治療糖尿病腎病藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

2.2 核心藥物組合作用機(jī)制

2.2.1 核心藥物組合化合物篩選及靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果 經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢、篩選并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)補(bǔ)充，初步提取丹參化合物202種、赤芍化合物119種、牡丹皮化合物55種；根據(jù)化合物篩選要求，共篩選出化合物105種，其中丹參65種、赤芍29種、牡丹皮11種。對(duì)105種化合物進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，共得到化合物相關(guān)靶點(diǎn)745個(gè)。

2.2.2 糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)篩選結(jié)果 從GeneCards、TTD、DrugBank、Disgenet數(shù)據(jù)庫中分別獲得糖尿病腎病相關(guān)靶點(diǎn)1541、13、40、64個(gè)，經(jīng)合并、去重后，共得到1581個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

2.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選結(jié)果 取化合物靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)交集后，將得到的571個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)果見圖1A。經(jīng)篩選后，共得到關(guān)鍵靶點(diǎn)47個(gè)（表2），對(duì)其再次構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖1B。47個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)歸屬于67種化合物，使用中藥首字母及序號(hào)對(duì)67種化合物進(jìn)行編號(hào)以利于后期分析，如MDP3表示歸屬于牡丹皮的第3個(gè)化合物；共有化合物用A及序號(hào)表示，如A1表示丹參和赤芍的共有化合物。67種化合物包括丹參48種（DS1-DS47、A1）、牡丹皮7種（MDP1-MDP4、A2-A4）、赤芍16種（CS1-CS12、A1-A4），其中包括丹參與赤芍共有化合物1種（A1）、牡丹皮與赤芍共有化合物3種（A2、A3、A4）。

圖1 潛在靶點(diǎn)與關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

表2 核心藥物組合關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.2.4 GO及KEGG通路富集分析 為進(jìn)一步闡明關(guān)鍵靶點(diǎn)的潛在作用機(jī)制，將47個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行GO及KEGG通路富集分析。經(jīng)分析，關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及細(xì)胞膜筏、細(xì)胞囊腔等51個(gè)細(xì)胞組成成分，激酶結(jié)合、蛋白激酶活性等78個(gè)分子功能，細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、激酶活性的正向調(diào)節(jié)等333個(gè)生物過程及AGE-RAGE、HIF-1138等138條信號(hào)通路，前20條信號(hào)通路見表3。使用R語言對(duì)前20條富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化，見圖2（封四）。

圖2 GO與KEGG通路富集分析氣泡圖

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路富集結(jié)果（前20條）

2.2.5 核心藥物組合作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖 應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件對(duì)丹參、赤芍、丹皮67種化合物及相對(duì)應(yīng)的47個(gè)靶點(diǎn)，以及靶點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的主要通路進(jìn)行分析，構(gòu)建核心藥物組合作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

圖3 核心藥物組合作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

糖尿病腎病為臨床常見的糖尿病并發(fā)癥，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病程較長，是糖尿病最常見的死因之一。目前普遍認(rèn)為，持續(xù)高血糖的刺激和血流動(dòng)力學(xué)的改變是導(dǎo)致腎損傷并加速進(jìn)入糖尿病腎病末期的主要原因。糖尿病腎病發(fā)病過程中，終末期糖基化產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、多元醇通路等多種細(xì)胞活動(dòng)和信號(hào)通路的激活及大量細(xì)胞因子生物活性的相互作用都參與了糖尿病腎病的發(fā)展過程[19]。

呂仁和教授認(rèn)為，糖尿病以“熱傷氣陰”為基本病機(jī)，若糖尿病失治誤治，久病入絡(luò)，在氣陰兩虛甚至陰陽兩虛的基礎(chǔ)上，痰熱瘀郁相互膠結(jié)，瘀阻脈絡(luò)，形成“微型癥瘕”，進(jìn)而損傷腎體，導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生[20]。丹參、牡丹皮、赤芍三味中藥在呂仁和教授處方中出現(xiàn)頻率最高，為呂仁和教授治療糖尿病腎病的核心藥物。三味藥物均可活血化瘀，入血又可涼血散血，與糖尿病腎病“熱傷氣陰”“微型癥瘕”的病機(jī)相契合。三味藥物功效類似，聯(lián)合配伍使用，則清熱化瘀之力更強(qiáng)。

糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且中藥復(fù)方成分、靶點(diǎn)及通路眾多，對(duì)中藥作用機(jī)制的研究較為緩慢，故丹參、赤芍、牡丹皮治療糖尿病腎病的作用機(jī)制尚未闡明。經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索，本研究共篩選出105種化合物、47個(gè)化學(xué)成分與疾病共同作用靶點(diǎn)、333個(gè)生物過程和138個(gè)潛在信號(hào)通路，這些結(jié)果都體現(xiàn)了丹參、赤芍、牡丹皮在治療糖尿病腎病過程中多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)。

研究表明，丹參具有抗炎、改善血液流變學(xué)、減輕腎臟細(xì)胞損害、抗腎纖維化等作用[21]。丹參酮ⅡA能阻斷AGE-RAGE信號(hào)通路，改善氧化應(yīng)激水平，起到減緩糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展的作用[22]。丹參酚酸可降低腎間質(zhì)纖維化大鼠血肌酐、尿素氮和羥脯氨酸水平，可能與抑制腎組織MMP-2和TIMP-2的蛋白表達(dá)，從而改善腎間質(zhì)纖維化水平有關(guān)[23]。赤芍是常用的活血化瘀中藥之一，具有抗氧化、改善神經(jīng)系統(tǒng)損傷、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛的作用[24]。現(xiàn)代研究表明，赤芍可降低糖尿病腎病大鼠血脂、尿素氮、血肌酐水平，其作用機(jī)制可能與抑制腎臟ET-1表達(dá)，降低PKC及TGF-β1水平相關(guān)[25]。芍藥苷是赤芍的主要成分之一，Wang等[26]發(fā)現(xiàn)芍藥苷可通過上調(diào)P-PI3K和P-Akt的表達(dá)并下調(diào)P-IRS-1蛋白來改善胰島素信號(hào)缺陷。牡丹皮具有保肝、護(hù)腎、清熱、降糖、激活機(jī)體免疫系統(tǒng)等多種藥理作用[27]。Zhang等[28]研究表明，牡丹皮可顯著增加谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的活性，并能下調(diào)腎組織中轉(zhuǎn)化生長因子β2蛋白的表達(dá)，即牡丹皮減弱了晚期糖化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞功能障礙以及高糖脂肪飲食和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。槲皮素是牡丹皮中的化學(xué)成分，其可以抑制多元醇通路的限速酶即醛糖還原酶的生成，從而起到延緩和防治糖尿病并發(fā)癥的作用[29]。這些與本研究篩選出的結(jié)果基本一致，提示了本研究預(yù)測的潛在作用機(jī)制的可行性，且有待后續(xù)動(dòng)物或細(xì)胞試驗(yàn)的驗(yàn)證。