甲型流感病毒H1N1單克隆抗體特性鑒定和應用①

劉 楊 趙向絨 郭春艷 李 研 胡 軍

（陜西省人民醫院中心實驗室，西安交通大學醫學院第三附屬醫院，西安710068）

甲型流感病毒（influenza A virus）屬正黏病毒科，流感病毒屬，是引起急性呼吸道感染的主要病原體之一，抗原易變異，多次引起世界性大流行，給人類生命健康和經濟發展造成極大危害。隨著我國經濟發展迅速，跨地區交流、合作、旅游等日益頻繁，大中型城市擴建及大部分地區城鎮化建設逐年增加，城鎮人口居住密集，為流感傳播提供了有利條件。因此，流感的快速檢測、治療、病毒變異及病毒致病機制研究具有重要意義。特異性單克隆抗體（monoclonal antibody，mAbs）在流感病毒快速檢測、動物感染模型保護效果評價及病毒研究領域應用廣泛［1-2］。本研究采用A/PR/8/34（H1N1）流感病毒顆粒免疫小鼠制備mAbs，并鑒定抗體特性，評價抗體在免疫熒光、細胞免疫化學染色和ELISA中的作用，為流感快速檢測及研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 A/PR/8/34（H1N1）甲型流感病毒為本實驗室保存毒株；MDCK細胞為陜西省疾病預防控制中心病毒所惠贈；9日齡SPF雞胚購自北京實驗動物中心；普通雞胚購自西安華禽養殖場；6～8周齡BALB/c小鼠購自西安交通大學醫學院實驗動物中心；CP90WX超速離心機購于自日本日立公司；熒光顯微鏡購自OLYMPUS；辣根過氧化物酶（HRP）和牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司；胎牛血清購自北京元亨圣馬生物技術研究所；RPMI1640和DMEM培養基購自Gibco公司；mAb亞型鑒定試劑盒、FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體購自Southern biotech公司；BCA微量蛋白定量試劑盒、FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體購自Thermo Fisher Scientific公司；TPCK-胰酶購自Sigma公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋。

1.2 方法

1.2.1 病毒雞胚培養和純化 取A/PR/8/34（H1N1）毒種接種于9日齡雞胚尿囊腔，35℃培養72 h，收集尿囊液，4℃下甲醛滅活。3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，收集上清，30 000 r/min（離心半徑9.21 cm）超速離心4 h，PBS（100 mmol/L，pH=7.2）重懸，鋪于預先制備的5%～60%蔗糖密度梯度液，水平轉頭（P40ST）20 000 r/min（離心半徑15.88 cm）離心6 h，收集病毒層，BCA微量蛋白定量試劑盒對純化產物進行總蛋白濃度定量，按照試劑盒說明書進行，收集病毒層置于-80℃保存［3］。

1.2.2 mAbs制備 BALB/c小鼠腹腔注射純化的A/PR/8/34（H1N1）病毒顆粒抗原進行免疫，0.05 mg/只，每隔2周加強免疫，融合前3 d追加免疫。無菌條件下取免疫小鼠脾臟研磨并與Sp2/0細胞混合，50%PEG4000溶液進行細胞融合，加入鋪有飼養細胞的96孔板，HAT培養基選擇培養，間接ELISA法檢測雜交瘤細胞培養上清，篩選陽性孔按有限稀釋法進行亞克隆，建立mAb細胞株。RP?MI1640培養基（含10%胎牛血清）培養陽性雜交瘤細胞，雜交瘤細胞一部分凍存作為細胞種子，一部分腹腔內注射于BALB/c小鼠（腹腔內注射0.2 ml石蠟油后10 d的小鼠），0.2 ml/只（1.25×104個），10 d左右收集腹水［4］。

1.2.3 mAbs反應特性鑒定按照mAb亞型鑒定試劑盒說明書進行抗體類和亞類鑒定。采用建立的ELISA法檢測抗體效價，單抗腹水依次進行倍比稀釋，進行ELISA試驗，Sp2/0細胞腹水作為陰性對照。mAbs特異性和交叉反應性鑒定：分別將A/PR/8/34（H1N1）、A/Shaaxi/01/2009（H1N1）抗原、A/Shaanxi/01/2014（H3N2）抗原、胎牛血清、正常雞胚尿囊液等不同抗原包被ELISA板，分別加入mAbs，檢測與抗原是否具有交叉反應性。

1.2.4 中和試驗 無菌條件下收集小鼠腹水，56℃滅活30 min，4倍系列稀釋mAb，分別取50μl與等體積半數組織細胞感染量（50%tissue culture infec?tious dose，TCID50，）病毒液混合，37℃孵育2 h，加入含有MDCK細胞的96孔板中，37℃孵育5～7 d，以MDCK細胞未出現CPE的最大抗體稀釋度的蛋白濃度作為mAbs中和滴度。

1.2.5 血凝抑制（HI）試驗 測定流感病毒血凝滴度，流感病毒培養液2倍系列稀釋后加入“U”型孔中，取等量0.5%雞紅細胞懸液與其混合室溫靜置1 h，以出現紅細胞完全凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度的倒數作為血凝滴度。2倍系列稀釋mAb后加入“U”型孔中，與4個紅細胞凝集單位的A/PR/8/34（H1N1）病毒混合，室溫靜置30 min。加入0.5%雞紅細胞懸液后充分混勻，室溫靜置1 h，以不出現紅細胞凝集的最高稀釋度為終點，其稀釋度對應的抗體蛋白濃度作為HI效價。具體方法參照“WHOManual on Animal Influenza Diagnosis and Sur?veillance”。

1.2.6 免疫熒光試驗 DMEM培養基（含10%胎牛血清）培養MDCK細胞，待細胞長至單層后移去細胞培養液，加入DMEM培養基（含0.002 mg/ml TPCK-胰酶）病毒培養液，接種流感病毒，未接種流感病毒的正常細胞作為對照，待接種病毒的細胞病變效應（CPE）達到50%～75%時，分別收集病毒感染細胞和對照組正常細胞，4%多聚甲醛室溫固定1 h，PBST洗3次，加入抗mAbs，37℃孵育1 h，PBST洗6次，加入FITC標記的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育1 h，PBST洗6次，伊文氏藍襯染5 min后，置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 細胞免疫化學染色試驗 DMEM培養基（含10%胎牛血清）培養MDCK細胞，待細胞長至單層后移去細胞培養液，加入DMEM培養基（含2μg/ml TPCK-胰酶）病毒培養液，接種流感病毒，并設立未接種流感病毒的正常細胞為對照，待接種病毒的細胞病變效應（CPE）達50%～75%時，分別收集病毒感染細胞和對照組正常細胞，10%甲醛室溫固定1 h，PBST洗3次，加入抗mAbs，37℃孵育1 h，PBST洗6次，加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1 h，PBST洗6次，蘇木素室溫染色10 min，分化、返藍后置顯微鏡下觀察。

1.2.8 雙抗體夾心ELISA法 0.5 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH=9.6）分別稀釋mAb PR8-24和PR8-25至濃度為0.005 mg/ml，0.1 ml/孔包被96孔板，4℃靜置過夜，PBST洗3次，5%BSA封閉液于37℃孵育1 h，2倍系列稀釋500 TCID50A/PR/8/34（H1N1）流感病毒液，0.1 ml/孔加入酶標板孔中，37℃孵育1 h，PBST洗6次，分別加入HRP標記的mAb PR8-25和PR8-24，0.1 ml/孔，37℃孵育1 h，PBST洗6次，加入TMB顯色液37℃孵育10 min，加入2 mol/L H2SO4終止液，測定450 nm處吸光度（OD450）。

1.3 統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行兩變量線性相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 分泌抗A/PR/8流感病毒mAbs的雜交瘤細胞株建立 共獲得13株抗A/PR8/34（H1N1）mAb雜交瘤細胞株，效價均＞104，mAbs反應特性見表1，PR8-15為IgG3，其他12株均為IgG1亞類。PR8-10、PR8-19、PR8-20、PR8-26、PR8-28和PR8-30單抗HI滴度均≤3μg/ml，血凝抑制活性較強。PR8-13和PR8-15無中和活性，其他11株均具有中和活性。具有中和活性的mAbs PR8-10、PR8-14、PR8-16、PR8-18、PR8-19、PR8-20、PR8-24、PR8-25、PR8-26、PR8-28和PR8-30的HI與MN滴度相關性分析結果顯示，HI與MN滴度呈正相關（Pearson相關性=0.952，P＜0.01，R2=0.906，圖1）。

2.2 mAbs特異性和交叉性鑒定 細胞免疫熒光試驗結果顯示，PR8-10、PR8-14、PR8-24、PR8-25、PR8-26、PR8-28、PR8-30 mAbs可與A/PR/8/34（H1N1）流感病毒感染的MDCK細胞結合，不與正常MDCK細胞反應（圖2）。細胞免疫熒光試驗分析單抗交叉反應特性顯示，PR8-24可與A/Shaanxi/02/2014（H1N1）結合，不與A/Shaanxi/01/2014（H3N2）結合。PR8-25、PR8-26、PR8-28、PR8-30可與A/Shaanxi/01/2014（H3N2）反應，不與A/Shaanxi/02/2014（H1N1）反應（圖3）。

2.3 mAbs在細胞免疫化學試驗中的應用 采用PR8-24、PR8-25、PR8-28、PR8-30 mAbs進行細胞免疫化學染色試驗，均可特異性與A/PR/8/34（H1N1）流感病毒感染的MDCK細胞結合，特異性著色主要分布于細胞漿（圖4）。

表1 mAbs特性（μg/ml）Tab.1 Characteristics of mAbs（μg/ml）

圖1 HI滴度與MN滴度線性相關性分析Fig.1 Linear correlation analysis between HI titer and MN titer

2.4 雙抗體夾心ELISA法建立 根據抗體滴度、HI滴度、特異性、MI滴度和配對檢測A/PR/8/34（H1N1）病毒靈敏性，共篩選出2株用于雙抗體夾心ELISA法構建的mAbs，分別為PR8-24和PR8-25。雙抗體夾心ELISA法檢測結果顯示，包被PR8-24和HRP標記PR8-25配對時，病毒培養液線性范圍為15.6～500 TCID50，R2=0.996 5。包被PR8-25和HRP標記PR8-24配對時，病毒培養液線性范圍為15.6～500 TCID50，R2=0.997 9。以PR8-24作為包被抗體和以PR8-25作為酶標抗體配對雙抗體夾心ELISA的檢測最低限為15.6 TCID50/0.1 ml，以PR8-25作為包被抗體和以PR8-24作為酶標抗體配對雙抗體夾心ELISA的檢測最低限為62.5TCID50/0.1 ml（圖5）。

圖2 IFA鑒定mAbs與A/PR/8/34（H1N1）流感病毒感染MDCK細胞的反應特性Fig.2 Identification of response characteristics of mAbs to MDCK cells infected with A/PR/8/34（H1N1）influenza virus by IFA

圖3 IFA試驗鑒定流感病毒感染MDCK細胞Fig.3 IFA test for identification of MDCK cell infection by influenza virus

圖4 流感病毒感染MDCK細胞細胞免疫組化試驗Fig.4 Cell-based immunohistochemistry test of MDCK cells infected with influenza virus

圖5 ELISA測定A/PR/8/34/（H1N1）流感病毒培養上清的標準曲線Fig.5 Standard curve of A/PR/8/34（H1N1）influenza virus culture supernatant detection by ELISA

3 討論

H1N1流感病毒是導致流感流行的主要甲型流感病毒，由于H1N1流感病毒抗原漂移和抗原變異頻率較高，針對H1N1的流感疫苗需要不斷變化以維持保護作用。甲型流感病毒有2個重要的表面糖蛋白，分別為血凝素和神經氨酸酶，其中血凝素蛋白在病毒黏附和進入宿主細胞過程中發揮重要作用，同時也是刺激機體產生中和抗體的主要病毒結構蛋白［5-6］。根據血凝素蛋白功能，其蛋白可分為3個結構域，分別為受體結合域、位于血凝素頭部下面的退化酯酶結構域和鄰近病毒包膜的莖部區域，莖部區域是低pH觸發膜融合激活結構域。血凝素抗體可識別并結合血凝素頭部或莖部，中和抗體與血凝素頭部結合后可抑制病毒黏附，而抗體與血凝素莖部結合后可抑制病毒與宿主細胞膜融合，抑制血凝素HA0被蛋白酶水解為HA1/HA2。

甲型流感病毒的抗原表位，尤其是中和表位主要位于病毒血凝素和神經氨酸酶上，而血凝素和神經氨酸酶為病毒包膜上的糖蛋白。KUENSTLING等［7］利用原核表達系統表達重組低聚HA1蛋白，重組低聚HA1蛋白純化過程中經過適當折疊可使免疫小鼠產生中和抗體，但基因工程技術表達的血凝素或神經氨酸酶蛋白可能與自然病毒的血凝素或神經氨酸酶結構不同，尤其是空間構象表位不同，血凝素糖基化修飾數量和質量及糖基化修飾位置對其抗原性及抗體交叉反應性具有重要作用，決定抗原與抗體間的親和能力和中和活性［8］。流感病毒也可通過血凝素糖基化逃避中和抗體結合，導致免疫逃避［9］。因此，課題組以純化的H1N1流感病毒作為免疫抗原，盡可能保證病毒抗原表位與天然結構一致，常規免疫BALB/c小鼠制備mAbs，盡可能制備及篩選出特異性抗甲型流感病毒mAbs，為后續研究提供依據。本研究共制備13株穩定分泌抗A/PR8/34（H1N1）mAbs的雜交瘤細胞株，均具有HI活性，其中6株HI滴度≤3μg/ml。PR8-13和PR8-15無中和活性，其他11株均具有中和活性，mAb HI滴度與MN滴度呈正相關，mAb HI滴度與各MN滴度變化趨勢一致，mAb HI活性較高時，相應mAbs MN活性也較高，而HI試驗較MN試驗操作簡單、實驗周期短、結果判定客觀，因此，血凝素抗體可用HI活性在一定條件下間接反映MN活性。此次制備的PR8-13和PR8-15 mAbs具有HI活性，無MN活性，表明具有HI活性的抗體不一定具有MN活性，而其他11株mAbs既有MN活性又具有HI活性，表明具有MN活性的血凝素抗體大多具有HI活性，主要與抗體結合的抗原表位有關，MN抗體可識別并結合血凝素頭部或莖部，與血凝素頭部結合后可抑制病毒黏附和血凝素介導的膜融合［10-12］。而與血凝素莖部結合后可通過阻斷pH誘導的血凝素構象改變抑制病毒與宿主細胞膜融合［13］，也可抑制血凝素HA0被蛋白酶水解為HA1/HA2，血凝抑制活性的抗體主要識別并結合于血凝素頭部，因此，推測PR8-13和PR8-15 mAbs可能只結合于血凝素頭部。另外，MN抗體也可通過Fc段介導抗體依賴的細胞毒性效應和補體依賴的細胞毒效應［12］。

PR8-24、PR8-25、PR8-26、PR8-28和PR8-30不僅可與A/PR/8/34（H1N1）反應，也可與A/Shaanxi/01/2014（H3N2）反 應，其 中PR8-24可 與A/Shaanxi/02/2014（H1N1）反應，推測A/PR/8/1934（H1N1）血凝素蛋白與A/Shaanxi/01/2014（H3N2）或A/Shaanxi/02/2014（H1N1）具有相似抗原表位，尤其是A/Shaanxi/01/2014（H3N2）。與此同時，PR8-24、PR8-25、PR8-28和PR8-30既可用于IFA試驗也可用于細胞免疫化學染色，在流感病毒感染細胞或動物模型中，可依據抗體工具進行免疫組化或IFA試驗分析病毒感染水平，也可根據血凝素表位進行病毒亞型鑒定［14-15］。mAbs不僅可用于病毒感染研究，YEO等［16］利用2株配對的抗H7亞型流感病毒單抗建立了銪納米顆粒熒光免疫層析檢測H7流感病毒法，該方法比膠體金免疫層析檢測敏感性高25倍，免疫層析技術的最大優點在于實現病毒快速定性檢測，但不能用于定量分析，因此，本研究采用上述13株mAbs隨機配對設計雙抗體夾心ELISA法檢測A/PR/8/34（H1N1），篩選出PR8-24與PR8-25可用于雙抗體夾心ELISA檢測，并以PR8-24作為包被抗體和以PR8-25作為辣根過氧化物酶標記抗體建立雙抗體夾心ELISA時斜率最大，效果最好，ELISA的相對定量線性檢測范圍為15.6～500 TCID50，可為H1N1流感病毒快速定量方法的建立提供基礎，以及用于病毒血凝素蛋白定量或疫苗抗原定量分析［17］。TCID50測定病毒滴度周期較長，一般需要5～7 d，并以觀察細胞病變效應或以血凝活性判斷結果，結果判斷主觀性強，而采用預先建立的雙體抗夾心ELISA法可快速檢測病毒相對含量，且結果數據為吸光度值，結果較為客觀。RAJENDRA等［18］巧妙設計出可以檢測HA莖部正確折疊與否的捕獲ELISA法，以抗血凝素頭部線性表位為包被抗體，以抗血凝素莖部空間構象表位的抗體為檢測抗體，既可定量分析病毒血凝素含量，也可檢測血凝素莖部保守區空間構象是否正確折疊，為流感病毒研究、疫苗含量測定、抗原表位及空間構象分析提供支持。

甲型流感病毒是目前秋冬季節呼吸道感染的主要病原體，對甲型流感病毒的致病性、病毒毒力、疫苗、抗原保護位點及治療藥物研究顯得尤為重要，而此次制備的抗甲型流感病毒H1N1 mAbs為流感病毒的進一步研究提供基礎，也為后續病毒快速定量檢測提供技術支撐。由于本實驗室甲型流感病毒各種亞型代表株不全，不能與其他亞型的甲型流感病毒進行交叉分析，需進一步詳細鑒定mAbs反應特性，依據抗體特性分析其抗原表位及應用。