中藥調控腦缺血后海馬內源性神經發生與修復的研究進展*

高家樂，姚明江，劉建勛

(中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所中藥藥理北京市重點實驗室，北京 100091)

腦卒中指各種因素引起腦內動脈狹窄、閉塞或破裂，造成急性腦血液循環障礙及腦部供血受阻，繼而導致腦功能障礙，約80%的腦卒中是由于缺血性因素引起[1]。腦卒中作為多發常見的重大疾病，不僅是全球第五大死亡原因，也是導致成年人殘疾的主要原因，腦卒中后遺癥嚴重影響著患者的健康和生活，然而目前仍然沒有神經保護劑作為抗缺血性腦卒中藥物被認可，無論是已上市的藥物還是常用的治療方法都不能促進腦卒中后的神經修復和神經發生[2-3]，卒中后神經修復的機制與方法亟待研究。成年海馬神經發生與學習和記憶等認知功能有關，神經發生受阻會導致認知和情緒障礙[4]，腦缺血會引起海馬損傷，認知功能受缺陷，嚴重的發展為血管性癡呆。海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)顆粒下區(subgranular zone，SGZ)是成年哺乳動物腦內神經發生的主要位點之一，成年期可以不斷地產生新的神經元，有助于學習和記憶功能的維持[5]。

中藥具有多成分、多靶點、多層次、多途徑的綜合優勢，通過改變神經干細胞的微環境以及調控內源性因素等來調節神經干細胞的增殖和分化，能夠促進神經發生[6-7]。筆者總結成年海馬神經發生的機制及過程、海馬顆粒下區神經干細胞微環境對神經發生的影響以及中藥在防治腦缺血過程中對海馬的調控作用，以期為中藥促進腦缺血后海馬內源性神經發生與修復的相關研究提供參考。

1 海馬神經發生機制及過程

神經干細胞(neural stem cell，NSC)具有自我更新的能力，可以分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，以構建和維持大腦結構和功能單位[8]，在胚胎發育和成年神經發生過程中起著重要作用。神經發生是對局灶性腦缺血的一種反應，腦缺血能夠激活海馬SGZ的神經干細胞，促進神經發生[9]。海馬SGZ成年神經干細胞在發育為新生的顆粒神經元并功能性整合入海馬回路之前，會經歷幾個連續的發育階段，包括增殖、分化、遷移、軸突延伸和突觸整合[10]，受到一系列信號的調控。在不同發育階段，細胞類型有Ⅰ型細胞、Ⅱa型細胞、Ⅱb型細胞、Ⅲ型細胞以及未成熟和成熟的神經元，其中Ⅰ型細胞是海馬SGZ中具有NSC特性的放射狀膠質樣細胞(radial glia-like cells，RGLs)，表達巢蛋白(nestin)，可產生具有瞬時擴增特性的Ⅱ型中間神經祖細胞(neural progenitor cells，NPCs)，增殖能力增強，其又可以分為IIa和IIb兩種亞型，雙皮質素(doublecortin，DCX)和巢蛋白均呈陽性，這些Ⅱ型細胞可以產生Ⅲ型遷移神經母細胞，特征為DCX陽性、巢蛋白陰性以及多唾液酸型神經細胞黏附分子陽性，遷移到顆粒細胞層，在成熟之前擴增隨后退出細胞周期，進入短暫的有絲分裂后階段，形成未成熟的神經元，再過2～3周期后轉化為成熟的新生顆粒神經元[11-12]，將軸突投射到海馬CA3區，樹突投射到海馬DG的分子層以接受興奮性突觸輸入[13]。除了神經元的產生外，還能產生少量膠質細胞如星形膠質細胞等。海馬內嗅皮層經過DG、CA3和CA1區構成三突觸神經回路，海馬齒狀回成年新生神經元的增加不僅有助于三突觸神經回路的可塑性，而且提供了海馬結構和功能的可塑性[14]，海馬神經回路及細胞類型見圖1。

圖1 海馬三突觸回路及細胞類型簡圖

2 海馬SGZ區神經干細胞微環境對神經發生的影響

神經干細胞微環境主要包括與神經干細胞相鄰的細胞、細胞因子、細胞外基質和微血管網等，海馬SGZ區微環境細胞組成主要包括星形膠質細胞、神經元以及增殖細胞[15]。星形膠質細胞在腦缺血后的神經發生與修復中起著雙向作用。一方面，在腦缺血發生后幾分鐘內，缺血核心區和半暗區帶產生腫瘤壞死因子(TGF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-6等因子，觸發星形膠質細胞的活化，引起反應性星形膠質細胞增生，形成膠質瘢痕，阻礙軸突再生，還能產生促炎因子，增加炎癥反應等[16]，不利于神經發生；而另一方面，星形膠質細胞也能分泌和釋放一些趨化因子和生長因子，到達神經發生位點，促進神經祖細胞增殖、遷移到達缺血區[17]，另外星形膠質細胞本身也能轉分化為神經元。SHEN等[18]研究表明，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通過增加巢蛋白和Pax6的表達促進成年大鼠缺血損傷紋狀體中的反應性星形膠質細胞向神經干細胞轉化，進一步增強反應性星形膠質細胞分化為新的成熟神經元，從而促進神經發生。ASRICAN等[19]研究發現，海馬齒狀回膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)中間神經元釋放一種內源性神經肽即CCK。CCK釋放增加能夠促進星形膠質細胞谷氨酸遞質的釋放，進而激活放射狀膠質神經干細胞中的絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶1信號，促進神經干細胞的穩定增殖和分化。

細胞因子有成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、VEGF、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等。FGF參與血管生成，具有促進神經發生和突觸生成，保護神經元并促進神經元的存活等功能[20]，其中FGF-2可促進神經元的軸突分支和突觸發生，在腦缺血損傷后通過增加樹突分枝和樹突棘密度來促進神經功能的恢復[21]。BDNF在中樞神經系統中含量最豐富、分布最廣泛，通過結合和激活受體酪氨酸激酶B(tyrosine receptor kinase B，TrkB)或共受體p75NTR發揮作用，其中BDNF與TrkB受體結合可顯著促進由腦缺血誘導的神經再生，尤其是海馬SGZ區[22]。BDNF也可通過激活環磷酸腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)和蛋白激酶PKA來促進神經元成熟和神經發生，越來越多的研究表明，BDNF和磷酸化CREB是調節海馬神經發生和改善認知功能的關鍵因素[23]。VEGF可促進血管生成，血管生成是指從預先存在的血管中分支形成新的微血管，包括內皮細胞的增殖和發芽、管狀血管結構的形成、分支和吻合，在腦缺血后4～7 d內發生，主要在缺血核心區和周邊交界處，新生血管的生成可使阻塞微血管再通，促進缺血半影區損傷神經元的恢復[24-25]。血管新生和神經發生二者密切相關，缺血后新生血管通過VEGF和laminin/β1-integrin 信號引導軸突發芽，通過一些胞外信號、提供營養物質以及作為遷移支架等促進海馬SGZ內源性NSC/NPC增殖，向梗死周圍區域遷移和分化為成熟的神經元，從而促進腦缺血后神經重塑和功能性恢復[26]。

3 中藥對腦缺血后海馬神經發生與修復的干預作用

3.1中藥單一有效成分黃芪甲苷(astragaloside VI，AsVI)能夠改善腦缺血-再灌注大鼠的學習記憶和運動功能，提高海馬DG區BrdU/DCX、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP陽性細胞的表達率以及上調海馬巢蛋白、p-EGFR和p-MAPK的表達，表明AsVI能夠有效激活EGFR/MAPK信號通路從而促進NSC增殖和神經發生[27]。在體外缺氧條件下，川芎嗪能夠促進大鼠神經干細胞增殖和向神經元分化，MAPK信號通路參與這一過程，可能與ERK和p38的磷酸化有關[28]。川芎嗪硝酮(tetramethylpyrazine nitrone，TBN)是川芎嗪的合成衍生物，易于穿透血-腦屏障，研究發現，TBN能減輕雙側頸總動脈結扎大鼠海馬CA1區神經元損傷和抑制星形膠質細胞激活，通過調節PI3K/Akt/GSK3β通路保護海馬神經元免受氧糖剝奪誘導的凋亡，增加軸突萌發及生長，促進軸突的可塑性，此外還能增加腦缺血模型大鼠腦內BDNF的表達，推測增加的BDNF與TrkB結合從而激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路[29]。天麻素能夠促進腦缺血后海馬神經發生，可能與PDE9-cGMP-PKG信號通路有關[30]。淫羊藿苷能夠改善雙側頸總動脈結扎誘導的血管性癡呆大鼠的空間學習和記憶能力，抑制海馬CA1區神經元丟失，可能與激活海馬組織BDNF/TrkB及其下游Akt和ERK/CREB信號通路有關[31]。

3.2中藥有效成分配伍梓醇和葛根素制成凍干粉后，能夠增加海馬DG區BrdU和NeuN陽性細胞的數量，促進小鼠缺血側海馬DG的神經發生[32]。黃芪甲苷、三七總皂苷以及冰片三者配伍后能增加大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠海馬CA1區巢蛋白和NeuN陽性細胞的表達，促進腦缺血-再灌注后神經細胞的增殖、神經元的分化與成熟，且配伍后藥物效應增強，顯著促進Wnt/β-catenin信號通路的激活，促進細胞增殖和神經發生[33]。

3.3中藥復方研究表明，補陽還五湯通過星形膠質細胞縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)對海馬神經元的樹突復雜性以及樹突棘可塑性產生影響，表現為海馬神經元樹突長度、節點數、終末分支數以及樹突棘密度大體呈增長趨勢，CA1、CA3和DG區以CD31表達量來計算的微血管密度表達水平均升高，從而促進腦缺血-再灌注后修復期的神經元修復和血管再生[34]。升降散能夠呈劑量依賴性地促進慢性腦缺血血管性癡呆大鼠海馬組織的病理性損傷修復及VEGF和巢蛋白的表達，上調海馬組織 Wnt 信號通路關鍵蛋白 p-LRP，p-GSK3β 和 β-catenin 蛋白水平，促進血管新生和神經干細胞分化，可能與激活Wnt信號通路活性有關[35]。當歸芍藥散能夠增加小鼠腦缺血后海馬DG區Ki67、DCX陽性細胞以及BrdU/DCX、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP陽性細胞的數量，可能通過增加Akt/GSK3β/β-catenin信號轉導來促進腦缺血后海馬DG神經發生[36]。參歸三圣散提取物能夠增強MCAO大鼠感覺運動功能和識別記憶能力，改善腦血流量和梗死面積，促進腦缺血后海馬神經發生，可能與調節BMP2/4和Notch1/Hes5信號通路有關[37]。頤腦解郁復方可能通過上調 Notch通路中的Notch1和Hes1基因表達，增加海馬DG神經元數量和抑制星形膠質細胞的過度激活，動態調節海馬神經發生，對卒中后抑郁大鼠起到治療作用[38]。

由此，中藥可通過抑制星形膠質細胞的過度激活、促進神經元的存活，增加細胞因子如VEGF和BDNF的表達，促進血管新生等來改善腦缺血后海馬顆粒下區微環境，從而促進神經干細胞的增殖、遷移、分化等，有利于海馬內源性神經發生。然而中藥促進腦缺血后海馬內源性神經發生涉及的信號通路復雜，單一的中藥有效成分可能涉及不同通路，不同的中藥有效成分涉及的通路也可能相同，中藥配伍以及對應通路間的復雜作用機制需要進一步研究。

以上中藥研究情況匯總見表1。

表1 中藥調節腦缺血后海馬神經發生與修復的作用機制

4 結束語

腦缺血后誘發的機體內源性神經發生是一種代償性反應，絕大多數增殖后的神經細胞會死亡，故提高腦缺血后新生神經細胞的存活率非常重要。人類海馬始終保持產生新生神經元的能力，如果在腦缺血后能夠最大程度地激活海馬顆粒下區神經干細胞，并提高其增殖后存活的數量，促進海馬神經發生，可能對神經功能的修復有很大貢獻。中藥能夠改善腦缺血后的微環境，對海馬神經發生與修復起到促進作用，而其中機制復雜，仍需進一步探究。此外，星形膠質細胞能夠轉分化為神經元，但轉化不當會引起神經細胞和膠質細胞的比例失調紊亂，導致神經功能異常，而腦缺血后會引起星形膠質細胞增殖，對神經發生有利有弊，中藥能否通過促進營養因子的分泌等促使星形膠質細胞轉分化為神經元，并維持這種轉化的平衡，以達到促進神經發生的作用，值得進一步研究。另外，在神經發生的不同階段，用來識別和確定不同特征的亞群細胞的分子標記物繁雜，不同腦區的神經細胞適宜的標記物也有所差別，故在今后的研究中應該慎重選取具有代表性的標記物，或同時采用多個標記物來確定某一特定類型的細胞，以便更好探究中藥促進腦缺血后神經發生與修復的作用機制。