青藤堿對脂多糖誘導損傷H9c2大鼠心肌細胞的保護作用

劉月，楊文健，孫曉東，桑明，焦蓉

(湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院兒科，襄陽 441000)

膿毒癥是一種由感染引起的失控的全身性炎癥反應，具有發病率高、死亡率高等特點，是重癥監護病房患者死亡的主要原因之一[1-2]。約50%膿毒癥患者會出現不同程度的心肌損傷[3-4]，死亡率高達70%[1]。膿毒癥心功能障礙的致病因素有多種，其中炎癥反應、凋亡和氧化損傷在心肌損傷的發生發展中發揮了重要作用[4]。目前臨床上針對膿毒癥心功能損傷的治療措施以改善循環、營養等對癥支持治療為主，仍缺乏特異性治療方法[4]。因此迫切需要尋找新的治療膿毒癥心肌損傷的藥物。青藤堿(sinomenine)是一種嗎啡烷類生物堿，主要來源于防己科植物青風藤的根和莖，具有廣泛的藥理作用，如顯著的鎮痛、鎮靜、抗心律失常、抗氧化和抗炎作用[5-7]。青藤堿藥用形式多為鹽酸鹽，臨床上廣泛應用于治療風濕病、關節炎、癌癥和系膜增生性腎炎等疾病，并且沒有明顯的不良反應[5，8-10]。研究證實，青藤堿可通過抑制損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMPs)誘導的“炎癥風暴”來改善脂多糖誘導的炎癥損傷，發揮重要的抗內毒素和抗炎效應[11]。但是，青藤堿對于脂多糖誘導的心肌損傷研究較少。本實驗以H9c2大鼠心肌細胞為研究載體，以脂多糖刺激，比較不同濃度的青藤堿或作用不同時間對心肌細胞的影響，探討青藤堿對脂多糖誘導損傷的心肌細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1細胞株H9c2大鼠心肌細胞購自中國科學院細胞庫(中國上海)，用含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的高糖達爾伯克必需基本培養液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)完全培養液培養，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養箱中，飽和濕度下進行常規培養。觀察培養液顏色變化和細胞生長狀態，及時換液，細胞處于對數生長期時用于實驗。

1.2藥品與試劑青藤堿(Aladdin公司，批號：S101688，含量≥97%)；脂多糖(美國Sigma公司，批號：L4391，血清型0111：B4)；高糖DMEM培養液(Gibco，批號：8118110)；胎牛血清(四季青公司，批號：20170315)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、青鏈霉素雙抗(Gibco，批號：25200056，15240062)；Trizol(MRC公司，批號：TR118)；CCK-8試劑盒(Biosharp公司，批號：BS350A)；兔抗鼠Bax抗體(批號：14796)、兔抗鼠Bcl-2抗體(批號：2764)、兔抗鼠caspase-3抗體(批號：9664)、兔抗鼠caspase-9抗體(批號：9508S)、兔抗鼠絲裂原活化的細胞外信號調節激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK)抗體(批號：9154，9126)、兔抗鼠細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)抗體(批號：4370，4695)和兔抗鼠GAPDH抗體(批號：5174)均來自Cell Signaling Technology公司。

1.3細胞處理H9c2大鼠心肌細胞分為正常對照組：細胞培養24 h后，給予無血清的培養基饑餓處理12 h，再更換為完全培養基；脂多糖組：細胞加藥前饑餓處理12 h，加入10 μg·mL-1脂多糖，孵育4，8 或12 h；青藤堿組：細胞饑餓處理12 h后分別加入25，50，100 μmol·L-1青藤堿作用30 min，再予以10 μg·mL-1脂多糖孵育4，8或12 h。

1.4細胞活性測定使用CCK-8試劑盒測定細胞活力。取生長狀態良好的對數期H9c2細胞，按每孔8000個細胞密度接種于96孔板，每孔100 μL。待細胞生長至每孔面積的85%后，更換為無血清的高糖DMEM培養基，饑餓處理12 h后，向各孔內加入25，50，100，150，200 μmol·L-1青藤堿，重復5個孔，每孔100 μL。同時，部分孔加入完全培養基100 μL作為正常對照組。12 h后，向各孔中加入CCK-8溶液10 μL，并繼續孵育，4 h后使用酶標儀檢測540 nm處各孔的吸光度(A)值，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(A給藥組-A空白)/(A對照組-A空白)×100%。

1.5實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定向12孔板各孔中加入 Trizol試劑300 μL，反復吹打后收集上清液，提取各組細胞RNA。使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和oligo dT將每組 RNA樣品2 μg逆轉錄為cDNA。按照說明書要求，采用SYBR Green在7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)進行RT-PCR。GAPDH用作參照基因。使用2-△△CT計算腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)的相對mRNA水平。引物序列如下：TNF-α上游：5′-AGCATGATCC GAGATGTGGAA-3′，下游：5′-TAGACAGAAGAGCGTGGTGGC-3′；IL-1β上游：5′-GGGATGATGACGACCTGCTAG-3′，下游：5′-ACCACTT-GTTGGCTTATGTTCTG-3′；IL-6上游：5′-GTTGCCTT CTTGGGACTGATG-3′，下游：5′-ATACTGGTCTGTTGT-GGGTGG T-3′；MCP-1上游：5′-AGTCGGCTGGAGAA-CTACAAGA-3′，下游：5′-CTGAAGTCCTTAGGGTTGAT-GC-3′；GAPDH上游：5′-GACATG CCGCCTGGAGAAAC-3′，下游：5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′。

1.6免疫印跡(Westernblotting)測定提取各組細胞蛋白質：在6孔板內各加蛋白裂解液500 μL，冰上裂解細胞30 min，12 000 r·min-1離心10 min后獲得蛋白上清液。使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白質測定試劑盒測定各組蛋白質濃度。每組樣本混勻后取40 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)，然后轉移到聚偏二氟乙烯[poly(vinylidene fluoride)，PVDF]膜(Millipore，Billerica，MA，美國)。由TBST配置的5%脫脂奶粉封閉PVDF膜90 min，再用一抗封閉液孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌5次后，二抗室溫下再孵育1 h，后用TBST清洗5次。配制電化學發光顯色液，在暗房中顯影。

1.7統計學方法采用SPSS 17.0版軟件進行統計學分析。使用T-test和方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1青藤堿對細胞活力影響青藤堿和(或)脂多糖作用H9c2心肌細胞12 h后檢測各組細胞的活力(n=5)，正常對照組細胞活性為100%，而25，50，100，150，200 μmol·L-1青藤堿處理12 h后各組細胞活力依次為97.0%，96.5%，94%，93.5%，92.0%，較正常對照組存活率稍有下降，但均差異無統計學意義(均P>0.05)。濃度<200 μmol·L-1的青藤堿對細胞活力的影響較小，差異無統計學意義，可排除青藤堿對細胞活性的影響，不干擾本實驗結果。

2.2青藤堿對H9c2心肌細胞炎癥因子的影響 脂多糖組H9c2細胞TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1 mRNA水平均顯著高于正常對照組，青藤堿組炎癥因子的mRNA水平顯著下降，其中100 μmol·L-1青藤堿作用最為顯著(P<0.01)。脂多糖作用心肌細胞4 h后，TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的mRNA水平即明顯升高，并且在12 h內達最高水平，而青藤堿組在12 h內IL-6、IL-1β和MCP-1基因水平均顯著低于脂多糖組，見圖1。青藤堿呈劑量和時間依賴性抑制脂多糖誘導的心肌炎癥因子的基因水平。

A.正常對照組；B.脂多糖組；C.青藤堿25 μmol·L-1組；D.青藤堿50 μmol·L-1組；E.青藤堿100 μmol·L-1組。①與正常對照組比較，t=6.80～19.69，P<0.01；②與脂多糖組比較，t=6.80～30.80，P<0.05；③與脂多糖組比較，t=14.50～38.40，P<0.01。

2.3青藤堿對細胞凋亡的影響見圖2。與正常對照組比較，脂多糖不同程度地促進心肌細胞的凋亡，caspase-3和caspase-9蛋白表達量明顯升高，Bcl-2/Bax比值顯著下降；與脂多糖組比較，青藤堿組caspase-3和caspase-9表達量顯著下降，Bcl-2/Bax比值明顯升高。其中，與作用0.5 h比較，青藤堿對caspase-3和caspase-9的抑制作用在2 h時效果更為顯著。較青藤堿25 μmol·L-1組，青藤堿100 μmol·L-1組H9c2細胞Bcl-2/Bax比值顯著升高，心肌細胞凋亡顯著改善。

A.正常對照組；B.脂多糖組；C.青藤堿25 μmol·L-1組；D.青藤堿50 μmol·L-1組；E.青藤堿100 μmol·L-1組。①與正常對照組比較，t=5.00～22.05，P<0.01；②與脂多糖組比較，t=10.90～11.85，P<0.01；③與脂多糖組比較，t=7.20，P<0.05。

2.4青藤堿對MEK/ERK1/2通路的影響 見圖3。脂多糖組p-ERK和p-MEK表達量與正常對照組比較顯著升高，并且脂多糖作用2 h后p-ERK和p-MEK表達量顯著高于脂多糖作用0.5 h組，說明脂多糖呈時間依賴性地升高p-ERK和p-MEK蛋白水平。青藤堿組蛋白表達量較脂多糖組顯著下降，并且青藤堿處理2 h內磷酸化的ERK和MEK表達量均低于脂多糖組。

A.正常對照組；B.脂多糖組；C.青藤堿100 μmol·L-1組。①與正常對照組比較，t=10.00，41.00，P<0.05；② 與正常對照組比較，t=22.00～71.00，P<0.01；③與脂多糖組比較，t=10.29，18.58，P<0.05；④與脂多糖組比較，t=22.47，24.60，P<0.01。

3 討論

心功能障礙是膿毒癥患者常見的并發癥，嚴重影響患者預后。心功能障礙的發生伴隨著過度的炎癥反應、線粒體功能障礙和凋亡。脂多糖是公認的一種致病因子，可誘發膿毒癥[12]。本研究采用10 μg·mL-1脂多糖刺激H9c2建立心肌損傷模型，脂多糖處理H9c2以后，細胞促炎因子水平顯著升高，細胞凋亡增多，提示模型制備成功[13]。

近年來越來越多的研究發現，青藤堿可顯著抑制炎癥反應，作用機制為：抑制損傷相關分子模式誘導的“炎癥風暴”來改善脂多糖誘導炎癥損傷[14]；抑制P38絲裂原活化蛋白激酶和核因子-κB信號通路發揮抗炎作用[5]。Caspase-3是caspase信號通路中凋亡的關鍵執行者。青藤堿可調控caspase的活化以誘導各種細胞凋亡[15]。青藤堿在不同的疾病中對凋亡的作用不同，如在腫瘤的病程中，青藤堿促進癌細胞凋亡，抑制癌癥病程[16-17]；在非惡性腫瘤的病程中，青藤堿抑制功能細胞凋亡，減輕組織損傷[15，18-19]。

脂多糖作用后，炎癥因子過度表達，心肌細胞凋亡壞死，青藤堿則顯著降低細胞促炎癥因子水平，并下調caspase-3和caspase-9，抑制細胞凋亡，部分阻斷MEK/ERK的活化。MEK/ERK作為絲裂原活化蛋白激酶家族中的重要成員，調控細胞凋亡、增殖和分化。脂多糖與TLR4結合激活下游信號通路，激活MEK/ERK，促進細胞凋亡[20-21]，提示青藤堿可能通過抑制MEK/ERK的活化來抑制凋亡，改善心肌細胞損傷。此外，青藤堿也可通過Nrf2-keap1-PKC通路改善膿毒癥小鼠氧化應激損傷[22]；通過煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)抑制巨噬細胞中CD14/TLR4的表達，激活JAK2/STAT3通路，抑制機體TNF-α、MCP-1、MIF和MMP-9的表達水平，改善炎癥損傷[23]。

本研究的局限性為沒有進行動物實驗，沒有直觀觀察青藤堿對膿毒癥大鼠心功能和生存率的影響。其次，應用H9c2細胞進行實驗，而非大鼠原代心肌細胞，這兩種細胞在生理特性上仍存在差異。但是，本研究不僅探究了青藤堿的抗炎效果，還探究了不同作用時間及濃度對心肌細胞的作用，為膿毒癥心功能障礙的治療提供新的治療方向。