基于網絡藥理學紅花三味散治療非酒精性脂肪肝病的作用機制*

阿潤，王秀蘭，策力木格，王徽

(內蒙古民族大學蒙醫藥學院，通遼 028000)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是由于三酰甘油在肝細胞內大量聚集引起的慢性肝病，可發展成肝硬化或肝癌[1]。全球流行病學調查表明，普通成人NAFLD患病率6.3%～45%，包括中國在內的亞洲多數國家NAFLD患病率處于中上水平[2]。NAFLD是現代醫學病名，蒙醫中沒有完全匹配的病名。多數蒙醫學者認為NAFLD屬于“通拉嘎未消化癥”的范圍，蒙醫治療該病時以調理體素，平衡“三根”，清熱解毒，清“肝希拉熱”，祛“巴達干希拉”，抑制“赫依”增生為原則，針對各種類辨證施治[3]。

蒙藥紅花三味散由紅花、梔子、菊花三味藥組成，具有清血熱、清肝熱和保肝利膽功效，主要用于肝損傷和脂肪肝[4]。始載于《甘露四部》[5]，其中菊花和梔子為國家衛生健康委員會認定的藥食同源藥材，紅花既是中醫蒙醫常用藥材，也可作為保健食品。前期實驗研究表明，紅花三味散對D-氨基半乳糖誘導的急性肝損傷大鼠具有顯著的保護作用，其保肝作用機制可能與抑制氧化應激、炎癥反應有關[4]。由于紅花三味散具有多成分、多靶點、多途徑的協同作用等特點，其有效成分的作用靶點及分子機制目前尚不清楚。網絡藥理學突破了傳統“單靶點、單途徑”的研究理念，從整體性、系統性的角度研究中藥及復方的成分、靶點、疾病之間的網絡關系，為闡明民族醫藥科學內涵提供了新的思路與方法[6]。因此，筆者借助網絡藥理學的思路，探討紅花三味散治療NAFLD的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗用軟件及在線工具本文研究需要使用較多軟件及在線工具，如活性成分篩選時利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，化合物靶標預測時使用STITCH和Swiss Target Prediction，利用在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)和DisGeNET分別進行NAFLD發病機制靶標的預測，在繪制網絡拓撲圖時需要安裝Cytoscape軟件，詳細內容見表1。

表1 本文研究使用的軟件及在線工具

1.2紅花三味散中活性成分的篩選通過檢索TCMSP分別收集紅花、梔子和菊花中主要的化學成分，按照化學成分的口服生物利用度[oral bioavailability(OB)>30%]、類藥性[drug-likeness(DL)>0.18]的化學成分作為候選活性成分。

1.3紅花三味散化合物的靶標預測將化合物導入PubChem中得到化合物的SMILE格式和2D structure，依據化合物相似性搜索和反向分子對接的方法采用STITCH、Swiss Target Prediction和TCMSP等網站預測化合物靶標。對以上3個數據庫的預測結果匯總、去重，整理收集到的靶點導入Uniprot數據庫，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱(official gene symbol)，作為紅花三味散化合物的預測靶標。

1.4構建紅花三味散活性成分-作用靶點的網絡根據紅花三味散中主要有效成分預測的靶點，建立活性成分-作用靶點之間的相互對應關系。將活性成分和作用靶點作為網絡中的節點(node)，兩者之間的相互作用作為網絡中的連接(edge)，制成Excel表格，導入Cytoscape軟件中，運用插件Network Analyzer計算網絡特征。

1.5NAFLD相關基因的收集從OMIM和DisGeNET數據庫中通過檢索關鍵詞“non-alcoholic fatty liver disease” “nonalcoholic fatty liver disease”和“NAFLD”收集疾病相關靶點，整理后建立NAFLD相關靶點數據集。通過紅花三味散活性成分靶點和NAFLD靶點匹配，得到紅花三味散治療NAFLD的潛在靶點。

1.6蛋白質-蛋白質互作網絡的構建String數據庫是一種包含已知和預測的蛋白質-蛋白質相互作用的數據庫。將紅花三味散的關注靶點導入String數據庫，獲取蛋白之間的蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖。

1.7生物學功能和信號通路注釋分析將關注基因導入DAVID數據庫，進行GO富集分析和KEGG通路注釋分析，并用錯誤發現率(false discovery rate，FDR)錯誤控制法(FDR<0.05)對P值作檢驗校正，最終設定閾值P<0.05，篩選差異有統計學意義的生物過程[7]，利用OmicShare繪圖。

1.8網絡構建采用Cytoscape軟件的Merge功能構建成分-靶點-通路網絡模型。網絡中每個節點的拓撲學用度數(degree)和接近中心(central)度進行評估。節點度數和接近中心度由Cytoscape插件Network Analyzer進行分析。

2 結果

2.1紅花三味散中活性成分的篩選在TCMSP數據庫里對其ADME性質進行評價，分別篩選得到紅花化學成分22種、梔子化學成分15種、菊花化學成分20種。其中槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇為三味藥共有成分，豆甾醇為紅花及梔子共有成分，γ-谷甾醇和木犀草素為紅花及菊花共有成分，鯊烯為梔子及菊花共有成分。所有活性化合物經去重后得到47種，基本信息見表 2。

表2 紅花三味散中的活性成分

2.2活性成分-靶點網絡構建與分析使用Cytoscape軟件將47種化合物與430個靶點構成化合物-靶點網絡。化合物-靶點網絡總共包括477個節點和1458條邊。其中，紅色節點代表紅花化合物，綠色節點代表菊花化合物，藍色節點代表梔子化合物，淺藍色節點代表化合物對應的潛在靶點，每條邊則表示化合物分子與靶點之間的相互作用關系(圖 1)。Degree的大小代表網絡中的關鍵度，槲皮素的作用靶點最多(degree>170)，其次是山奈酚(degree>82)、木犀草素(degree>77)、異鼠李素(degree>56)及黃芩苷元(degree>53)等。由此得知同一個活性成分作用于多個靶點，且這些具有多靶點的活性成分可能是藥理作用的核心點，這體現了紅花三味散多成分、多靶點的協同作用特點。

紅色代表紅花藥材化學成分；綠色代表梔子藥材化學成分；深藍色代表菊花藥材化學成分；黃色代表2種藥材或3種藥材共同成分；淺藍色代表靶點。

2.3潛在靶點的預測從DesGeNET和OMIM數據庫中收集到的227個NAFLD疾病相關的基因與活性成分的430個基因相映射，篩選出了42個紅花三味散治療NAFLD的潛在靶點，具體信息見表3。

表3 紅花三味散活性成分的潛在靶點信息

2.4蛋白質-蛋白質互作網絡分析將上述42個潛在靶點導入String數據庫中，限定物種為人，從而獲得蛋白質相互作用關系，導入Cytoscape軟件中構建蛋白質相互作用網絡，見圖2。圖2中節點表示蛋白質，邊表示蛋白質間的相互關聯，共涉及39個節點，239條邊。用節點的大小和顏色表示degree值的大小，節點越大對應的degree值越大，顏色由深紅變淡粉對應degree值的大小。用邊的粗細表示Combine score值的大小，顏色由深藍變淺藍對應Combine score值的大小。邊越粗，顏色深藍，邊粗時Combine score值越大。在靶點中，度值最高的前5位是：INS(degree>32)、白細胞介素(IL)-6(degree>29)、腫瘤壞死因子(TNF)(degree>26)、JUN(degree>23)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG)(degree>21)。

圖2 蛋白質-蛋白質互作網絡圖

2.5潛在靶點的GO富集將紅花三味散的關鍵靶點通過DAVID數據庫進行GO富集分析，即從生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細胞組分(cellular component)角度進行功能注釋。GO富集分析結果(P<0.05，FDR<0.05)表明紅花三味散在生物過程中與轉錄調控、藥物結合、老化等相關性最大；在分子功能中與DNA結合和藥物結合及類固醇激素受體活性相關性最大；在細胞組分中與質膜外側面相關性最大。詳細信息見圖3。

圖3 GO富集分析

2.6KEGG通路分析將紅花三味散的42個關注基因富集在KEGG通路時，富集結果(P<0.05，FDR<0.05)得到與NAFLD關聯度最高的13條相關通路，分別為PPAR信號通路、胰島素抵抗通路、NAFLD通路、乙型肝炎通路、南美錐蟲病通路、癌癥通路、炎癥性腸病通路、利什曼病通路、破骨細胞分化通路、類風濕性關節炎通路、TNF信號通路、百日咳通路及MAPK信號通路。詳細信息見圖4。

圖4 KEGG通路富集分析

2.7紅花三味散的網絡分析使用Cytoscape建立了紅花三味散治療NAFLD的“活性成分-靶點-通路網絡圖”，如圖5所示，能直觀地看到紅花三味散的關鍵靶點分布于不同的信號通路，從不同角度揭示多成分-多靶點-多通路的相互協調的作用特點。選取與NAFLD密切相關的NAFLD通路、胰島素抵抗通路和乙型肝炎通路，反向尋找了與這些通路相關的靶點、化合物及藥材，并使用Cytoscape分析網絡特征，觀察化合物與靶點的作用情況以及靶點在生物通路中的分布情況。網絡中介度和緊密度越高表示該靶點或化合物在生物網絡系統中發揮重要作用[8]。通過網絡分析發現INS、JUN、TNF、PPARA、RELA、IKBKB和IL-6等介度較高的7個靶點可能是紅花三味散調控NAFLD、胰島素抵抗和乙型肝炎三條通路的關鍵靶點，詳細信息見圖6、表4。紅花三味散調控NAFLD通路的機制：在單純性脂肪肝(simple steatosis)通路中化合物槲皮素、山奈酚及木犀草素等活性成分有效地抑制IL-6、TNF及INS等靶點，從而降低高胰島素血癥的產生及新脂肪酸的合成；在非酒精性脂肪肝炎通路(non-alcoholic steatohepatitis)中，紅花三味散的有效成分槲皮素、黃芩苷元、MOL002694等能夠抑制TNF-α、CYP2E1、IL-1、IL-6、IKBKB、FAS及TGF-β1等靶點，拮抗脂肪肝炎形成、細胞死亡、炎癥反應、肝臟纖維化及肝細胞損傷。

圖5 活性成分-靶點-通路圖

圖6 NAFLD通路、胰島素抵抗通路、乙型肝炎通路相關網絡模型

表4 NAFLD通路、胰島素抵抗通路和乙型肝炎通路網絡拓撲學參數

3 討論

蒙藥是蒙醫臨床用于治療和預防疾病的一種主要途徑，也是蒙醫藥研究的熱點之一。蒙醫方劑由多味藥靈活配伍而成，其多成分、多靶點既是蒙醫藥的特點，也是深入研究蒙藥的難點及重點。網絡藥理學整合了化學、醫學、生物數據、網絡模擬方法，其多靶點、多途徑、多層次的評價體系與策略，目前在中醫藥及民族醫藥的研究中有很大的預測作用[9]。網絡藥理學研究為探討蒙藥的作用機制及發現蒙藥的潛在作用靶點提供了新途徑。

本研究發現紅花三味散治療NAFLD的化合物以黃酮類化合物為主，拓撲學分析結果表明槲皮素的作用靶點最多，其次是山奈酚、木犀草素、異鼠李素、黃芩苷元。這些成分與NAFLD預測的核心靶標有高度相關性。紅花藥材中槲皮素、山奈酚及木犀草素的含量分別為0.197，0.394，1.45 μg·g-1[10-11]。梔子藥材中西紅花酸和京尼平龍膽雙糖苷的含量分別為0.889，35.566 mg·g-1[12-13]。梔子藥材中金合歡素、槲皮素、木犀草素、蒙花苷、二咖啡酰奎寧酸的含量分別為1.760，2.515，50.63 mg·g-1、0.301%和0.833 mg·g-1[14-17]。研究表明，槲皮素可以降低肝星狀細胞活化，預防肝纖維化，通過抑制TGF-β1/Smads信號通路和激活PI3K/AKT信號通路，抑制肝纖維化引起的自噬，從而減輕肝損傷[18]。山奈酚對急性肝衰竭小鼠具有保護作用，其作用機制可能通過調控核因子-κB信號通路而減輕肝臟炎癥反應[19]。木犀草素具有緩解乙醇所致的肝損傷的作用，其機制可能與降低自由基生成、減輕脂質過氧化有關[20]。異鼠李素對醋氨酚致人肝細胞的損傷具有拮抗作用，作用機制可能為提高細胞活性，改善受損細胞形態，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性，降低丙二醛含量，降低丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)的釋放量[21]。由此得知上述degree值大的化合物通過不同的作用機制發揮保肝作用。

通過KEGG信號通路分析發現，紅花三味散治療NAFLD主要通過調控胰島素抵抗通路、NAFLD通路、PPAR信號通路、乙型肝炎通路、癌癥通路、TNF信號通路及MAPK信號通路而實現。NAFLD發病機制尚不明確，臨床研究發現幾乎所有患者都有肝臟及周圍組織胰島素抵抗，其嚴重程度與NAFLD病情進展正相關[22]。周偉青等[23]研究發現茵陳蒿湯對NAFLD伴胰島素抵抗大鼠具有保肝作用，其機制可能是調節脂肪因子水平、改善糖脂代謝紊亂，從而逆轉肝細胞損傷有關。MAPK信號通路也是胰島素抵抗信號轉導途徑之一，目前發現5種MAPK信號轉導途徑[24]。王昱[25]發現油橄欖葉提取物可通過調節TLR4-p38 MAPK信號通路緩解肝臟脂肪變性和炎癥因子反應，抑制NAFLD的進展。PPAR對維持脂質代謝的平衡起著十分重要的調節作用。PPARα在肝臟高表達，它可通過調節與脂質代謝相關基因的表達，促進脂肪酸β氧化，并減少脂肪酸和三酰甘油的合成，從而減輕肝臟內脂質蓄積[26]。趙喜等[27]研究發現二苯乙烯經PPARα信號通路激活自噬從而治療大鼠高脂性脂肪肝。由此可知紅花三味散治療NAFLD是通過直接或間接調控胰島素抵抗信號通路、MAPK信號通路、PPAR信號通路和NAFLD通路等來實現。

本研究利用網絡藥理學方法初步預測了紅花三味散治療NAFLD的藥效物質基礎、核心靶點及可能的作用機制，為紅花三味散的后續開發研究提供了新思路和方向，下一步課題組將結合分子生物學實驗進行驗證。