基于磁固相萃取和液相色譜-質譜聯用技術的日本醫蛭抗凝活性成分研究*

黃小清，汪波，肖凌，聶晶

(1.武漢大學藥學院組合生物合成與新藥發現教育部重點實驗室，武漢 430071；2.湖北省藥品監督檢驗研究院國家藥品監督管理局中藥質量控制重點實驗室，武漢 430074)

日本醫蛭(Hirudonipponica，H.nipponica)是醫蛭科(Hirudinidae)醫蛭屬(Hirudo)的一種重要的傳統動物藥，在《神農本草經》《名醫別錄》等古醫學著作中均有相關記載[1]，也是2015版《中華人民共和國藥典》(一部)收錄的三大藥用水蛭品種之一。傳統中醫認為水蛭具有逐瘀破血的功效，國外也保留著活體水蛭療法用于治療靜脈充血的臨床應用[2]?，F代藥理研究表明，日本醫蛭相比其他兩種蛭類品種具有更強的抗凝血活性[3]。水蛭素類多肽成分是實現該功效的重要藥效基礎[1，4]，水蛭素最早提取自醫蛭科歐洲醫蛭(Hirudo Medicinalis)的唾液腺，也是現行唯一審批進入臨床使用的最強效凝血酶抑制劑以及天然抗凝劑[1，5]。對日本醫蛭轉錄組學的分析表明，其唾液腺組織表達水蛭素類抗凝多肽成分[6]。但在日本醫蛭抗凝成分研究中，以小分子化合物類成分報道居多[7-8]。日本醫蛭中生物大分子成分復雜，抗凝活性成分含量低，采用傳統溶劑提取和色譜分離純化的方法，通常需消耗數千克活體樣品，并且費時費力[9-10]，日本醫蛭抗凝成分的蛋白序列信息缺乏，質譜鑒定困難。

磁固相萃取通過外加磁場實現成分的快速分離，毫克級別的粗提物即可完成分離純化，具有簡便、快捷、耗樣量少的特點[11]，此外，功能化修飾能夠讓磁珠具有指定的物理化學性質，因而在科學研究[11]、環境監測[12]和生物醫學[13]等領域廣泛應用。本研究以日本醫蛭中抗凝活性大分子研究為例，合成凝血酶磁珠并應用于日本醫蛭中抗凝成分的篩選，同時構建日本醫蛭唾液腺蛋白序列庫用于抗凝成分的質譜驗證，以期為日本醫蛭抗凝生物大分子分離鑒定建立一種新方法。

1 材料與方法

1.1儀器傅立葉變換紅外分光光度計(Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR，Waltham，美國)，JEM-2010 FEF透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)，NanoPhotometer?分光光度計(IMPLEN，美國)，Agilent Bioanalyzer 2100系統(Agilent Technologies，美國)，自動化液相色譜-質譜聯用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析系統包括美國AB SCIEX公司TripleTOF 5600 型LC-MS/MS系統，配有電噴霧電離源以及三重四級桿飛行時間(triple quadrupole time-of-flight，TripleTOF)質量分析器，ChromXP C18色譜柱(75 μm×150 mm，3 μm，100 A，美國Eksigent公司)和Zorbax 300SB-C18捕獲柱(5 mm×0.3 mm，5 μm，美國安捷倫公司)。

1.2試劑及藥材原硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS，含量>99%，批號：T110596)，四氧化三鐵磁性納米顆粒(Fe3O4magnetic nanoparticles，MNPs，粒徑20 nm，含量>99%，批號：I109514)，聚乙烯吡咯烷酮，3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷[(3 glycidyloxypropyl)trimethoxysilane，GLYMO，含量>97%，批號：G107576)]，凝血酶發色底物(S2238，HD-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl，批號：113711-77-6)和牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA，含量≥96%，批號：A116563)均購自上海阿拉丁試劑有限公司；硫酸銨(含量≥99.0%)、乙酸(含量≥99.8%)、乙腈(含量≥99.5%)均由上海國藥集團化學試劑有限公司提供；人凝血酶(Sigma-Aldrich公司，西班牙)，纖維蛋白原(中國食品藥品檢定研究院，批號：140626-201611)，TRIzol Reagent kit(Thermo Fisher Scientific，美國，型號：15596026)，RNA-seq文庫構建試劑盒(New England Biolabs，美國，型號：E7530S)，AMPure XP beads(核酸分選磁珠，Beckman Coulter，Inc.，批號：E7490S)，核酸定量分析試劑盒(DNA HS Assay Kit，Agilent Technologies，美國，批號：50674626)。新鮮超純水由Milli-Q儀器凈化系統(Millipore，法國)制得。所用試劑均為分析級或分子級，除另有說明外，本研究所用緩沖溶液均為0.1 mol·L-1、pH值7.4的磷酸鹽(phosphate-buffered saline，PBS)緩沖液。

水蛭從湖北省荊門市京山縣采集并活體運回實驗室，-80 ℃保存，樣品經湖北省藥品監督檢驗研究院中藥檢驗研究中心肖凌老師鑒定為醫蛭科醫蛭屬日本醫蛭(Hirudonipponica)。

1.3凝血酶固定化磁珠制備及條件優化基于TEOS的水解反應制備二氧化硅修飾磁性納米顆粒(SiO2-modified magnetic nanoparticle，SMNPs)[11，14]，隨后對方法[15]進行了適量修改合成環氧硅烷化磁性納米顆粒(epoxy-coated magnetic nanoparticle，EMNPs)。將MNPs粉末(200 mg)超聲分散在17%聚乙烯吡咯烷酮水混合液中，所得產物繼續分散在異丙醇/氨/TEOS溶液(體積比18：7：1)520 mL中，連續機械攪拌15 h，即得SMNPs。取SMNPs粉末100 mg于50%乙醇50 mL中，超聲30 min，加入 GLYMO 0.4 g，所得懸浮液在氮氣(N2)保護下于50 ℃水浴7 h，產物真空干燥，即得EMNPs。

凝血酶通過開環反應固定于EMNPs表面，取EMNPs(10 mg)分散在含有33 U·mL-1凝血酶和1 mol·L-1硫酸銨的 PBS緩沖液1 mL中，37 ℃孵育8 h后收集磁珠，再與0.8%聚山梨酯-20/PBS液混旋1 h，即得凝血酶固定化磁珠。同時，BSA代替凝血酶進行上述固定化反應，合成BSA磁珠作為陰性對照磁珠。

分別對EMNPs與凝血酶反應比例以及PBS緩沖溶液pH值進行優化。比例優化時，分別將EMNPs2，3，6，9和12 mg與33 U·mL-1凝血酶溶液反應，所得磁珠采用酶活性檢測法測定磁珠活性。凝血酶與磁珠比例為3.67 U·mg-1時，所得磁珠的單位凝血酶活性值最大。pH條件優化實驗采用pH 值5，6，7，8和9的PBS緩沖液，結果顯示pH值為8時的酶活性值達到最大值，見圖1。

圖1 凝血酶固定化過程中的條件優化

1.5水蛭唾液腺分離以及轉錄組文庫制備取出水蛭的唾液腺組織[6]，根據TRIzol Reagent試劑盒操作說明提取組織總RNA，并在NanoPhotometer和Agilent Bioanalyzer 2100系統上進行純度和質量檢查，選取RIN score >7的RNA，使用poly-T寡鏈磁珠制備mRNA，在評估mRNA的數量和完整性后，參考RNA文庫制備試劑盒說明書構建cDNA文庫，AMPure XP beads用于純化cDNA片段，片段的大小使用DNA測定試劑盒在Agilent Bioanalyzer 2100系統上進行檢測，合格cDNA片段在Illumina HiSeq 6000平臺上進行雙向測序，測序長度為150 bp。

1.6日本醫蛭中抗凝成分篩選

1.6.1磁固相萃取及洗脫條件考察將“1.5”項下的唾液腺組織勻漿，5000×g離心10 min，上清液凍干即為L1樣品。取凝血酶磁珠10 mg于 L1溶液1 mL(50 mg·mL-1，PBS緩沖液配制)中，混旋30 min，混合溶液37 ℃水浴8 h，PBS緩沖液淋洗3次，隨即向磁珠中加入洗脫溶液1 mL，振蕩2 min，所得洗脫上清液即為L2樣品溶液。采用BSA磁珠同步上述操作，洗脫上清液即為陰性對照溶液(L3樣品溶液)。

洗脫條件優化，分別用30%，50%，70%乙腈/PBS溶液或乙醇/PBS溶液作為洗脫溶液完成上述磁固相萃取過程，采用文獻[17]報道的凝血酶滴定法測定洗脫液的抗凝血酶活性。

洗脫溶劑的條件優化結果表明，以30% 乙腈/PBS溶液作為洗脫溶劑時，洗脫液凍干粉具有最高的抗凝活性，為70 U·g-1。

1.6.2十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE)取L1樣品50 mg溶于 0.1 mol·L-1PBS緩沖液(pH值7.4)1 mL，制得L1樣品溶液，取優化條件下洗脫的L2、L3樣品溶液，經15% SDS-PAGE凝膠100 V電泳1.5 h，考馬斯亮藍R-250染色觀察。

1.6.3LC-MS/MS分析將L1、L2樣品分別以預冷丙酮(4 ℃)沉淀蛋白，沉淀復溶后，依次加入二硫蘇糖醇(終濃度10 mmol·L-1)、碘乙酰胺(終濃度40 mmol·L-1)完成還原以及烷基化反應，隨后以胰蛋白酶與樣本蛋白量1：50比例加入胰蛋白酶進行酶切，反應完成后12 000×g離心15 min，上清液脫鹽濃縮即得質譜分析樣品[18]。

LC-MS分析時，樣品經C18捕獲柱純化后，洗脫至C18分析柱分離，流動相A：3%二甲亞砜，97%水，0.1%甲酸；流動相B：3%二甲亞砜，97%乙腈，0.1%甲酸，100 min分析梯度，流速300 nL·min-1。數據采集在Triple TOF 5600系統上進行，采用數據非依賴采集模式，MS全掃描的質荷比(m/z)范圍為350～1500，離子累積時間250 ms，選取母離子信號大于120 cps的40個離子峰進行二級掃描，子離子m/z范圍100～1500，離子累積時間50 ms，電荷數為+2～+5，離子重復采集的排除時間為18 s[19]。

1.7數據分析運用ProteinPilot(V4.5版)軟件進行數據庫檢索，檢索算法為Paragon，日本醫蛭唾液腺蛋白序列數據庫為質譜檢索數據庫，結果以Unused≥1.3為標準進行篩選，過濾掉蛋白反庫中檢索到的條目和污染蛋白，余下所有蛋白序列信息在blast2 go(https：//www.blast2 go.com/blast2 go-pro/download-b2 g)上進行功能注釋。

2 結果

2.1功能化磁納米粒的表征及穩定性考察凝血酶磁珠通過3個連續步驟合成，并且所得磁珠可通過外加磁鐵輕易捕獲并收集，保證了磁固相萃取過程中的磁分離效果。SMNPs、EMNPs、凝血酶磁珠以及固相萃取后的凝血酶磁珠的FT-IR譜圖見圖2。在569.29 和1039.56 cm-1處的尖峰分別為Fe-O和Si-O鍵的伸縮振動峰，并且在SMNP和EMNP的3404.54 cm-1處出現了硅烷的O-H伸縮振動吸收帶，在圖2的4條譜線中都可觀察到所述吸收峰，表明SMNP的存在。EMNPs的2921.40 和2853.17 cm-1處出現的弱峰是環氧硅烷的C-H伸縮振動造成的，上述紅外吸收現象與文獻[20]報道的結果相符，凝血酶中存在烷基，凝血酶磁珠在2921.40 和2853.17 cm-1兩處吸收也有所增強，此外，凝血酶磁珠在1546.36 cm-1處的酰胺鍵特征吸收也證實凝血酶成功固定在磁珠上。

A.SiO2修飾磁性納米顆粒；B.環氧硅烷化磁性納米顆粒；C.凝血酶磁珠；D.萃取后的凝血酶磁珠。

運用透射電鏡對EMNP、凝血酶磁珠和磁固相萃取后的凝血酶磁珠的形態和尺寸進行表征，結果見圖3。形態上，3種磁珠幾乎呈球形，EMNPs呈現清晰的核-殼結構，直徑約為50 nm，萃取前后凝血酶磁珠直徑相仿，均約為EMNPs的5倍，文獻記載修飾后的磁納米粒直徑會增大[21]，與實驗過程以及FT-IR結果相符。

A.環氧硅烷化磁性納米顆粒；B.凝血酶磁珠；C.萃取后的凝血酶磁珠。

良好的酶活性穩定性是固定化酶的特征和優勢[20，22-24]。穩定性考察實驗中，按照“1.5”項下的酶活性檢測步驟，分別測定凝血酶磁珠、游離凝血酶在37 ℃、19 d間的酶活性，上述實驗均平行重復3次。固定化酶和游離凝血酶酶活性穩定性見圖4，10次活性檢測結果中，固定化酶的酶活力值的相對標準偏差值(RSD)為4.74%，而游離酶的RSD為22.96%，表明固定化酶的酶活性穩定性更好。

圖4 固定化和游離凝血酶在37 ℃、19 d內儲存穩定性

2.2轉錄組數據分析Illumina測序后，鑒定出24 625 284個原始序列讀長(raw reads)，過濾含有低質量堿基數(即Q ≤ 5)超過該條序列讀長(read)堿基數50%，N堿基含量超過該read堿基數10%以及含有測序接頭序列或含有poly-A的測序reads，最終獲得24 321 945條高質量序列讀長(clean reads)，使用Trinity(版本2.6.6)軟件進行序列組裝，將組裝的轉錄組序列中最長的序列作為后續分析的基因序列，共產生308 343個基因序列，長度分布在201～21 552 bp，N50長度為501 bp。選取合適的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列構建水蛭唾液腺的蛋白質數據庫，將現有的序列采用blastp算法比對到NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的非冗余蛋白質序列庫(Nr數據庫)和UniProtKB/Swiss-Prot數據庫中進行注釋匹配，最終得到13條水蛭素變體序列。

2.3水蛭抗凝成分篩選

2.3.1SDS-PAGE以及凝血酶滴定法驗證電泳結果見圖5，泳道1為蛋白相對分子質量標準，L3樣品的主要蛋白條帶的相對分子質量為45 000，為非特異性結合到磁珠上的蛋白。與L3樣品比較，L2樣品含有更寬泛的蛋白相對分子質量條帶，而L1樣品蛋白條帶多數小于15 000。多肽如水蛭素是水蛭中最強效抗凝血成分[4-5，25]，因此推測L2和L1中小分子多肽為抗凝多肽。

1.蛋白質相對分子質量標準；2.陰性對照樣品(L3)；3.萃取后樣品(L2)；4.萃取前樣品(L1)。

2.3.2LC-MS/MS鑒定結果樣品經質譜檢測比對后，共鑒定到蛋白1325種，其中L2樣品中1094種，L1樣品中987種，重疊蛋白數756。L1的注釋率為76%，L2樣本的注釋率為60%。

據文獻[25-26]記載，水蛭素是從吸血水蛭中分離出來的具有最強抗凝活性的天然凝血酶抑制劑，它可以直接與凝血酶的催化活性位點以及外結合域1結合。蛋白1023，1062，1230，1275和1323均為水蛭素變體(表1)，在Nr或Swissprot數據庫中的登錄號分別為APA20860.1，ALA14574.1，Q07558.1，P81492.2和APA20860.1，這5種肽在L2樣品中均能檢測到，而在L1樣品中均由于豐度極低而未能檢測，這是由于凝血酶磁珠對凝血酶抑制劑具有特異性富集效應。

表1 匹配日本醫蛭唾液腺轉錄組文庫所得蛋白比對結果

另外也鑒定出了非凝血酶抑制劑的抗血栓生物分子如失穩酶蛋白質834和846，它可以通過解聚穩定的纖維蛋白，但不與凝血酶活性位點結合而表達血栓溶解活性[25，27]，在L2以及L1樣本中均能檢測到相應的肽段數，這是由于磁珠的親水性Fe3O4核心以及硅烷涂層、聚山梨酯-20的疏水烷基會增強非特異性蛋白的吸附[28-29]。

3 討論

在本研究中，凝血酶通過三步修飾反應成功固定到磁珠，并且酶活性穩定性以及宏觀磁性良好，該方法原理簡單，操作簡便，適用于蛋白質類以及其他含有氨基的化合物的固定化實驗。維持最佳凝血酶活力的pH值約為7.4，而條件優化的最佳緩沖液pH值為8，這是由于凝血酶固定化反應過程中加入了一種強酸(H2SO4)弱堿(NH3·H2O)鹽硫酸銨，它會一定程度上下調緩沖液pH值[30]。比例優化實驗中，高比例EMNPs可以提供更多的環氧基團以確保與凝血酶的共價連接，但磁珠的聚集也更顯著，而聚集現象會大大減少固定化酶活性位點的暴露[22]，因此，本研究以單位酶活性值為優化指標，確定最佳比例。在磁固相萃取實驗中，本研究以30%乙腈溶液1 mL振蕩2 min，洗脫1次作為洗脫條件，測得洗脫液抗凝活性為70 U·g-1，當對磁珠再次洗脫后，所得洗脫溶液不具有抗凝活性，30%乙腈溶液1 mL洗脫一次能夠滿足實驗需求。

水蛭原液抗凝活性為1380 U·g-1，10 mg磁珠所得洗脫液的抗凝活性為70 U·g-1，回收率約為5.1%。本實驗中為了保持磁珠“垂釣”抗凝成分的作用并且降低經濟成本，限制了凝血酶的固定量，因而凝血酶的固定量較少，主要起到“垂釣”抗凝成分的作用，如果需要提高富集效果，可以增加固定凝血酶的比例。考慮到日本醫蛭缺乏參考基因組信息，針對大數據庫進行質譜檢索靈敏度低并且假陽性率高的問題[31]，因而構建了日本醫蛭唾液腺轉錄組文庫并翻譯為氨基酸序列數據庫用于蛋白質譜鑒定，該方法專屬性強，適用于特定樣本的蛋白質譜研究[32-33]，其中采用磁珠法進行mRNA的富集純化，該方法具有操作簡便、快速、純化效果好的特點[34-35]。

總之，通過結合磁固相萃取，轉錄組文庫建立以及LC-MS/MS技術，本研究建立了一種不需要復雜前處理即可從天然復雜樣本中快速篩選和鑒定目標生物活性大分子的方法，可為水蛭中抗凝生物活性分子的萃取以及鑒定提供參考。