miR-193a-5p靶向VASP干擾PI3K/AKT信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

殷玉敬，高 輝，岳 林，楊文濤，薛麗英

胃癌是多因素參與的復(fù)雜病變過(guò)程，是人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤[1-2]。miRNA可參與多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)，通過(guò)激活或抑制相關(guān)信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)功能，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-193a-5p在肺癌、膀胱癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等癌癥中顯著下調(diào)[3]。Xiao等[4]證實(shí)miR-193a-5p作為抑癌miRNA已被用于胃間質(zhì)瘤的診治靶點(diǎn)研究。PI3K/AKT信號(hào)通路活化可以抑制多種刺激誘發(fā)胃癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展、血管生成和轉(zhuǎn)移[5]。VASP是一種和肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)相關(guān)的多功能蛋白，研究表明miR-4455通過(guò)下調(diào)VASP可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活化，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[6]。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)VASP可能是miR-193a-5p的靶基因，但miR-193a-5p是否靶向VASP調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞增殖和凋亡尚不清楚。因此，本研究旨在探討miR-193a-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并分析VASP和PI3K/AKT信號(hào)通路的潛在作用，以期為治療胃癌提供有價(jià)值的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑 人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)收藏中心；人胃癌細(xì)胞株BGC-823和SGC7901購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素購(gòu)于Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)于Gibco公司，CCK-8試劑和胰蛋白酶購(gòu)于Sigma公司，miRNeasy Mini Kit試劑盒、miRNAeasy提取試劑盒購(gòu)于Qiagen公司，RT-qPCR購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，miR-NC、miR-193a-5p mimics、anti-miR-193-5p購(gòu)于上海拓然生物科技有限公司。VASP干擾RNA和對(duì)照干擾RNA均由上海生物工程有限公司合成構(gòu)建。RIPA裂解液、結(jié)晶紫染色液、BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)于碧云天公司，p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、β-actin一抗購(gòu)于美國(guó)CST公司，pcDNA3.1空載體、VASP過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-VASP由上海吉瑪生物科技有限公司合成構(gòu)建，LipofectamineTM2000購(gòu)于賽默飛公司。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司。Annexin V/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于BD生物科學(xué)公司。所有引物由上海鉑尚生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2主要方法

1.2.1胃癌組織標(biāo)本：采用胃癌患者60例的石蠟包埋標(biāo)本，其中男37例，女23例；年齡32～80歲，中位年齡54歲；病理分期：早期14例，中晚期46例；分化程度：高分化13例，中分化28例，低分化19例。所有患者術(shù)前未接受過(guò)放化療。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清、1.5×105U/L青霉素及50 mg/L鏈霉素；人胃癌細(xì)胞株BGC-823和SGC7901培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%胎牛血清、1.0×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素。所有細(xì)胞置于37℃、5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待BGC-823和SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度，以適當(dāng)密度接種至6孔細(xì)胞板中，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明將轉(zhuǎn)染miR-193a-5p mimics(miR-193a-5p)、轉(zhuǎn)染anti-miR-193a-5p(anti-miR-193a-5p)、轉(zhuǎn)染VASP干擾RNA(si-VASP)、共轉(zhuǎn)染miR-193a-5p mimics和pcDNA3.1-VASP(miR-193a-5p+VASP)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染無(wú)義序列或空載體作為陰性對(duì)照組(NC組)。

1.2.3RT-qPCR檢測(cè)miRNA和mRNA表達(dá)：按照實(shí)驗(yàn)要求將60例胃癌組織、癌旁組織及GES-1、BGC-823、SGC7901細(xì)胞根據(jù)Trizol試劑說(shuō)明提取細(xì)胞或組織中總RNA，使用miRNAeasy提取試劑盒提取miRNA。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。MiR-193a-5p和U6引物來(lái)源于MicroRNA RT-qPCR試劑盒。以U6和β-actin為內(nèi)參，計(jì)算miRNA和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。β-actin引物為：β-actin-F：5'-GGACCTGACTGACTACCTC-3'，β-actin-R：5'-TACTCCTGCTTGCTGAT-3'。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞以每孔4×103個(gè)的密度接種至96孔細(xì)胞板中，每孔加10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，每6孔為一組，分別于培養(yǎng)24、48、72和96 h時(shí)加入CCK-8溶液10 μl，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。取每天6孔平均值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的BGC-823和SGC7901細(xì)胞，并以1×109/L的濃度將細(xì)胞重懸于磷酸鹽緩沖溶液中，加Annexin V 5 μl和PI 5 μl室溫避光孵育15 min后，使用Accurri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，檢測(cè)結(jié)果使用FlowJo 7.6.2軟件分析,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-193a-5p與VASP的靶向作用關(guān)系：生物信息學(xué)TargetScan軟件預(yù)測(cè)miR-193a-5p與VASP-3'-UTR結(jié)合位點(diǎn)。參照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將構(gòu)建好的野生型VASP-3'-UTR-WT和突變型VASP-3'-UTR-WT的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及miR-con、miR-193a-5p mimics轉(zhuǎn)染至BGC-823和SGC7901細(xì)胞，6 h后換新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)試劑盒操作步驟檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集胃癌組織和癌旁組織研磨液、胃癌細(xì)胞BGC-823和SGC7901，用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中的總蛋白濃度。取20 μg變性蛋白上樣行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白凝膠轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后，置于含5%去脂奶粉的封閉液中4℃孵育過(guò)夜。以PBST洗膜后，再在4℃下將PVDF膜轉(zhuǎn)入1︰2000稀釋的一抗(VASP、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT)中反應(yīng)過(guò)夜，經(jīng)TBST洗膜后，加入1︰10 000稀釋的二抗于37℃下孵育1 h后行化學(xué)發(fā)光顯影，Image J分析目的條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1miR-193a-5p在胃癌組織和胃癌細(xì)胞BGC-823、SGC7901中的表達(dá) 以60例胃癌匹配癌旁組織和人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1為對(duì)照，RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，60例胃癌組織和胃癌細(xì)胞BGC-823、SGC7901中miR-193a-5p的表達(dá)均顯著下調(diào)，且BGC-823細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2miR-193a-5p對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)活力和凋亡的影響 通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，在胃癌細(xì)胞BGC-823和SGC7901中上調(diào)或下調(diào)miR-193a-5p表達(dá)，采用RT-qPCR檢測(cè)其在BGC-823和SGC7901細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-193a-5p組miR-193a-5p表達(dá)顯著升高，anti-miR-193a-5p組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。CCK-8法檢測(cè)BGC-823和SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)活力，結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-193a-5p組細(xì)胞生長(zhǎng)活力明顯降低，anti-miR-193a-5p組細(xì)胞生長(zhǎng)活力顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明miR-193a-5p可使BGC-823和SGC7901細(xì)胞的凋亡率顯著升高，而anti-miR-193a-5p組的細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。上述結(jié)果表明， miR-193a-5p過(guò)表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)誘導(dǎo)其凋亡。

圖2 RT-qPCR檢測(cè)BGC-823、SGC7901細(xì)胞中miR-193a-5p轉(zhuǎn)染效果

圖3 CCK-8法檢測(cè)BGC-823和SGC7901細(xì)胞增殖率

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BGC-823和SGC7901細(xì)胞凋亡率

2.3VASP與miR-193a-5p的靶向作用關(guān)系 通過(guò)TargetScan對(duì)miR-193a-5p和VASP結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)，示意圖見(jiàn)圖5。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-193a-5p能夠明顯降低VASP-3'UTR-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，而不影響VASP-3'UTR-MUT的熒光素酶活性(P>0.05)，見(jiàn)圖6A和B；miR-193a-5p過(guò)表達(dá)可負(fù)調(diào)控BGC-823和SGC7901細(xì)胞中VASP蛋白表達(dá)(P<0.05)，而anti-miR-193a-5p使VASP蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖6C和D。提示VASP是miR-193a-5p的靶基因。

圖5 miR-193a-5p與VASP的3'UTR結(jié)合位點(diǎn)示意圖

圖6 VASP與miR-193a-5p的靶向作用關(guān)系

2.4VASP對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 RT-qPCR和Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，胃癌組織VASP mRNA和蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖7，這與miRNA-193a-5p在胃癌組織中的表達(dá)相反，二者呈負(fù)相關(guān)(圖8)。轉(zhuǎn)染si-VASP后，BGC-823和SGC7901細(xì)胞中的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖9。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活力，結(jié)果顯示si-VASP轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞生長(zhǎng)活力較si-con組顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；反之轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VASP細(xì)胞使VASP蛋白過(guò)表達(dá)，細(xì)胞增殖顯著增加且細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖10。提示VASP可促進(jìn)BGC-823和SGC7901細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡。

圖7 RT-qPCR和Western blot檢測(cè)胃癌組織中VASP的mRNA和蛋白表達(dá)

圖8 胃癌組織中miR-193a-5p與VASP表達(dá)水平的相關(guān)性

圖9 RT-qPCR和Western blot檢測(cè)VASP轉(zhuǎn)染效果

圖10 CCK-8法檢測(cè)BGC-823和SGC7901細(xì)胞的增殖

2.5miR-193a-5p對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染的Ctrl組相比，miR-193a-5p組對(duì)BGC-823細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)有明顯抑制作用，而PI3K、AKT總蛋白表達(dá)變化不明顯，miR-193a-5p+VASP組則恢復(fù)了miR-193a-5p對(duì)p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖11。表明miR-193a-5p可干擾PI3K/AKT信號(hào)通路的活化。

圖11 miR-193a-5p抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活化

3 討論

胃癌是全球最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率。miR-193a-5p是miRNA家族中的一員，既往研究證實(shí)乳腺癌中miR-193a-5p表達(dá)降低，miR-193a-5p過(guò)表達(dá)顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[7]。還有學(xué)者指出肝癌細(xì)胞miR-193a-5p過(guò)表達(dá)顯著抑制肝癌細(xì)胞體外增殖和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)[8]。此外，干擾長(zhǎng)鏈非編碼RNA TTN-AS1對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用，分析原因與上調(diào)miR-193a-5p表達(dá)有關(guān)[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，癌組織miR-193a-5p表達(dá)顯著下降；miR-193a-5p過(guò)表達(dá)則BGC-823和SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)活力明顯下降，細(xì)胞凋亡率顯著升高，而沉默miR-193a-5p則可使細(xì)胞生長(zhǎng)活力提高，細(xì)胞凋亡率降低，這與Chou等[10]研究結(jié)論基本吻合。表明miR-193a-5p通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。

腫瘤細(xì)胞遷移能力與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。VASP是和肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)相關(guān)的多功能蛋白，能調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和伸展過(guò)程中肌動(dòng)蛋白重排，在細(xì)胞遷移過(guò)程中起重要作用[11]。Liu等[12]研究表明，缺氧可誘導(dǎo)VASP表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)改變上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型和基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，在體內(nèi)外激活A(yù)KT信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲。Tian等[13]證實(shí)VASP表達(dá)增加與乳腺癌患者預(yù)后不良呈正相關(guān)，干擾VASP表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移能力。有研究指出，miR-22、苦參堿抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲作用與下調(diào)VASP表達(dá)相關(guān)[14-15]。本研究RT-qPCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，胃癌組織VASP蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而VASP過(guò)表達(dá)可提升胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)活力和降低細(xì)胞凋亡率，沉默VASP則相反，故VASP具有致癌功能。經(jīng)TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)VASP可能是miR-193a-5p的靶基因，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了VASP與miR-193a-5p的靶向作用關(guān)系；miR-193a-5p過(guò)表達(dá)可負(fù)調(diào)控BGC-823和SGC7901細(xì)胞中VASP蛋白表達(dá)，而anti-miR-193a-5p過(guò)表達(dá)則可顯著上調(diào)VASP蛋白表達(dá)，證實(shí)VASP是miR-193a-5p的靶基因，且miR-193a-5p經(jīng)調(diào)控VASP表達(dá)影響胃癌細(xì)胞增殖和凋亡。PI3K/AKT信號(hào)通路通過(guò)磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡和血管生成等，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[16-20]。PI3K介導(dǎo)信號(hào)通路異常激活，可致AKT信號(hào)傳導(dǎo)，最后使腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[21-22]。p-AKT水平增加可致PI3K/AKT信號(hào)通路活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[23-24]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中PI3K/AKT信號(hào)通路上關(guān)鍵基因存在異常表達(dá)，同時(shí)該信號(hào)通路異常激活與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[19,25-26]。據(jù)報(bào)道，干擾miR-92b表達(dá)可抑制PI3K-AKT信號(hào)通路，從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖減少和細(xì)胞凋亡增加[27]。miR-150-3p、miR-21-5p等miRNA通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[28-29]。但胃癌組織中miR-129a-5p、VASP和PI3K/AKT信號(hào)通路間的相關(guān)性仍未知。本研究發(fā)現(xiàn)miR-129a-5p對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823中p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)有明顯抑制作用，而VASP過(guò)表達(dá)顯著減弱miR-129a-5p對(duì)p-PI3K、p-AKT的抑制作用；p-PI3K、p-AKT表達(dá)高低直接影響PI3K/AKT信號(hào)通路活性。表明miR-193a-5p通過(guò)靶向VASP干擾PI3K/AKT信號(hào)通路活化。故靶向miR-193a-5p/VASP途徑進(jìn)而阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路可能為胃癌治療提供新思路。

綜上，miR-193a-5p通過(guò)靶向VASP干擾PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡，具有抑癌作用。