sRAGE通過一氧化氮途徑抑制卵清蛋白誘導的小鼠變應性鼻炎

隋利萍, 李清華, 李 健, 趙運華, 郭有新, 鄭家華

(河北省承德市中心醫院耳鼻喉科，河北 承德 067000)

世界上大約有5億人患有過敏性鼻炎，這導致成人和兒童的生活質量下降，不僅在身體方面，而且在心理功能方面，增加了社會開支[1]。過敏反應的特征包含抗原特異性免疫球蛋白E(IgE)的產生；輔助性T細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞增多；過敏介質的釋放等。目前，該病的治療包括避免過敏原和藥物，包括皮質類固醇、抗組胺藥、抗膽堿藥、減充血劑、白三烯受體拮抗劑、肥大細胞穩定劑和免疫治療，這些藥物大多會引起各種副作用[2]。研究表明，sRAGE可通過競爭性結合RAGE而抑制其介導的炎癥反應[3]。一氧化氮(NO)是一種信號分子，由精氨酸產生，具有多種生理功能。變應性鼻炎患者鼻內NO濃度升高。既往研究顯示，高膽固醇患者配體-RAGE軸的激活可增加NO的合成[4]。因此，本實驗旨在探討sRAGE在小鼠變應性鼻炎模型中的作用及一氧化氮途徑的作用。

1 材料與方法

1.1材料:試劑:蛋白定量BCA試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；RIPA裂解液購自武漢博士德生物工程有限公司；PMSF購自中國碧云天生物技術研究所；離心機(Medifuge公司，意大利)；卵清蛋白，一種用于觸發T細胞活化的藥物(Sigma，美國)；Al(OH)3[氫氧化鋁](Sigma，美國)；sRAGE購自北京愛迪博生物科技有限公司；一抗(iNOS,β-actin)購自Abcam公司；細胞總RNA提取試劑盒、一步法實時定量熒光聚合酶鏈反應(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司，日本)。

1.2動物模型和實驗分組:選擇Balb/c小鼠(8周齡，雌性)，體重為20～22g。隨機分為三組，每組6只，分別為對照組(n=6)，變應性鼻炎組(n=6)，sRAGE干預的變應性鼻炎組(n=6)。變應性鼻炎組分別于第1、5、14、21天腹腔注射卵清蛋白40μg/kg和氫氧化鋁40mg/kg致敏小鼠，然后通過鼻腔給藥25mg/mL的20μL卵清蛋白激發14d。sRAGE干預的變應性鼻炎組，在小鼠第一次腹腔注射卵清蛋白前12h腹腔注射sRAGE，100μg/只，每12h注射一次，至最后一次滴鼻完成，余同變應性鼻炎組。對照組腹腔注射及滴鼻同等劑量的生理鹽水。

1.3鼻部抓撓行為評價:最后一次鼻腔激發后，立即記錄每只小鼠10min，以評估其鼻部抓撓行為。然后，用氯胺酮(80mg/kg，i.p.)和甲苯噻嗪(10mg/kg，i.p.)麻醉小鼠，采集血樣，摘除鼻腔。

1.4實時定量qRT-PCR:用TRIzol試劑(Invitrogen)從骨組織中分離總RNA，測定RNA的濃度和純度，測量了260nm處的吸光率和260/280nm的吸光率(Eppendorf，德國)。然后將RNA反轉錄成cDNA，用特異性引物進行PCR擴增。見表1。

表1 實驗中所用到的引物

1.5一氧化氮合酶蛋白表達測定：我們應用Westernblot測量小鼠鼻組織中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白的表達。用RIPA裂解液和PMSF溶解鼻黏膜組織。用SDS-PAGE法從各組鼻黏膜中分離出50～60μg總蛋白，并轉移到PVDF膜上。用5%脫脂乳封閉細胞膜，然后用抗iNOS(1∶1000；Abcam)、β-actin(1∶1000；Abcam)的一抗孵育。用TBST洗滌后，用辣根過氧化物酶結合二抗(1∶3000)孵育膜，并用化學發光系統(ChampChemi；SAGECREATION，北京)觀察免疫印跡并拍照，灰度值圖像J(NIH，Bethesda，MD)統計。

2 結 果

2.1sRAGE對卵清蛋白致小鼠變應性鼻炎鼻抓撓行為的影響:圖1顯示了卵清蛋白、氫氧化鋁和sRAGE對小鼠鼻抓撓行為的影響。與對照組相比，變應性鼻炎組的鼻抓撓次數明顯增多(P<0.05)。與變應性鼻炎組相比，sRAGE干預組的鼻抓撓次數明顯減少(P<0.05)，見圖1。

圖1 sRAGE阻斷卵清蛋白、氫氧化鋁誘導的雌性balb/c小鼠過敏反應

2.2sRAGE對卵清蛋白致小鼠變應性鼻炎鼻黏膜組織中IL-4和IFN-γ基因水平的影響:圖2，3顯示了sRAGE對各組小鼠鼻黏膜組織中IL-4和IFN-γ基因水平的影響。與對照組相比，變應性鼻炎組的IL-4 mRNA水平明顯升高，IFN-γ mRNA水平明顯降低(P<0.05)。與變應性鼻炎組相比，sRAGE干預組的IL-4 mRNA水平明顯降低，IFN-γ mRNA水平明顯升高(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 sRAGE降低卵清蛋白、氫氧化鋁誘導的小鼠鼻黏膜組織中IL-4的mRNA水平

圖3 sRAGE升高卵清蛋白、氫氧化鋁誘導的小鼠鼻黏膜組織中IFN-γ的mRNA水平

2.3sRAGE對卵清蛋白致小鼠變應性鼻炎鼻黏膜組織中iNOS蛋白水平的影響：圖4顯示了sRAGE對各組小鼠鼻黏膜組織中iNOS蛋白水平的影響。與對照組相比，變應性鼻炎組的iNOS蛋白水平明顯升高(P<0.05)。與變應性鼻炎組相比，sRAGE干預組的iNOS蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 sRAGE降低卵清蛋白、氫氧化鋁誘導的小鼠鼻黏膜組織中iNOS蛋白水平

3 討 論

本實驗研究了sRAGE對卵清蛋白致小鼠變應性鼻炎模型的影響及一氧化氮的作用。sRAGE可降低致敏小鼠的鼻抓撓次數，提示sRAGE可阻斷卵清蛋白、氫氧化鋁誘導的雌性balb/c小鼠過敏反應。進一步的研究結果顯示，與變應性鼻炎組相比，sRAGE干預組的IL-4 mRNA水平及iNOS蛋白水平明顯降低，IFN-γ mRNA水平明顯升高，提示sRAGE的抗過敏作用可能是通過炎癥反應和一氧化氮途徑實現的。sRAGE可能減輕變應性鼻炎鼻塞、頭痛等過敏癥狀。變應性鼻炎可顯著降低個人生活質量，嚴重影響社會開支。過敏反應最重要的部分是輔助性T細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、IgE生成和過敏介質釋放，這些都會導致受影響器官的急性功能改變[5]。

過敏性鼻炎中，一些介質包括IgE、組胺、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、CGRP、前列腺素、白細胞介素-1、類胰蛋白酶以及肥大細胞和一氧化氮的激活在過敏性鼻炎和偏頭痛中都很重要[6]。NO可引起神經源性炎癥、血管擴張血管通透性增高在變應性鼻炎的病理生理學中有重要作用。大量證據表明NO血管舒張神經傳遞途徑中起著重要作用[7]。鼻塞頭痛在過敏性鼻炎患者中很常見，IgE與肥大細胞和嗜堿性粒細胞結合后，炎癥介質的釋放可引起急性癥狀。肥大細胞和嗜堿性粒細胞的激活導致過敏性鼻炎患者的鼻塞頭痛。輔助性T細胞2(TH2)和輔助性T細胞1(TH1)之間的平衡在許多炎癥過程中起著重要作用，已知TH2細胞因子(包括IL-4、IL-5和IL-13)參與過敏性炎癥,TH1細胞因子(包括IL-12和IFN-γ)可抑制TH2反應，并在抑制過敏性級聯反應中發揮作用[8]，在我們的研究中，sRAGE降低了血清IL-4水平，而增加了IFN-γ水平，從而逆轉了TH2/TH1介導的小鼠過敏。因此sRAGE可能減輕變應性鼻炎的過敏癥狀。

一氧化氮(NO)是由一氧化氮合酶(NOS)的3種亞型[誘導型(iNOS)、內皮型(eNOS)和神經元型(nNOS)]產生的一種信號分子。以前的研究表明，iNOS產生的NO具有炎癥特性，而eNOS產生的NO具有抗炎作用[9]。在一些研究中，過敏患者的iNOS水平較高，但eNOS和nNOS與對照組相比沒有顯著差異[10]。與上述文獻相似，在我們的實驗中，sRAGE降低了小鼠過敏性鼻組織中iNOS的水平，從而降低了炎癥、過敏反應。

綜上所述，sRAGE可通過一氧化氮途徑影響炎癥機制，從而消除過敏性鼻炎的癥狀，包括鼻搔癢行為、IL-4及IFN-γ水平的改變。