TNF-α拮抗劑對激素聯合環磷酰胺治療類風濕關節炎合并間質性肺病療效的影響

陳旭艷，王青青，伊 雪，張 熠，陳永銓，范 薇，黃金梅，陳 金，董志高，肖萍萍

(1.廈門醫學院附屬第二醫院血液風濕免疫科，福建 廈門 361021 2.廈門醫學院基礎醫學部，福建 廈門 361023)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是以關節疼痛、變形及周圍軟組織腫脹為特點的全身自身免疫性疾病，早期病理改變為滑膜炎性反應，大約50%可出現關節外表現，如類風濕結節、血管炎、心包炎和肺部改變等，間質性肺病(interstitial lung disease，ILD)是RA累及肺部最常見的病變[1]。ILD作為一種肺間質的急慢性非特異性炎癥，病因復雜，發病機制尚不明確，早期表現為肺泡炎，隨著持續的炎癥損傷和修復，晚期逐漸進展為彌漫性肺間質纖維化，最后病人進展為呼吸衰竭，該病預后差，死亡率高[2]。ILD在RA患者發病率高達30%，而出現臨床表現僅有5%～10%，且ILD早期癥狀并不典型，容易漏診。晚期出現肺纖維化后預后極差，病死率甚至高達10%～20%[3]。研究證實，RA是屬于Th1型疾病[4]。且近年多項研究表明，多種炎癥細胞和細胞因子相互作用形成的復雜網絡促進了類風濕關節炎合并間質性肺病(RA-ILD)的發生和發展，尤其是輔助性T細胞Th1/Th2失衡、T細胞亞群、NKT細胞與這類疾病的關系成為研究的熱點，這為臨床RA-ILD的治療提供了新希望[5,6]。有研究直接提出Th1型細胞因子IFN-γ很有可能與RA-ILD的發病機制有關[7]。RA-ILD與類風濕因子(RF)、抗環瓜氨酸肽抗體(CCP-Ab)、抗角蛋白抗體(AKA)、免疫球蛋白(Ig)、補體C3和C4、血小板計數(PLT)及T淋巴細胞亞群間具有相關性，但研究較少，目前尚不能得出統一結論。研究表明TNF-α拮抗劑能有效緩解RA病情，減輕炎癥及關節破壞，阿達木單抗及戈利木單抗都是屬于全人源化抗TNF-α單克隆抗體，與TNF-α結合，降低其生物活性，進而控制疾病進展[8]。另外，TNF-α參與肺間質纖維化，所以我們猜想抑制TNF-α可能對抑制肺間質纖維化有一定的作用。RA-ILD的發病機制尚未完全明確，且RA-ILD目前傳統免疫抑制治療效果欠佳，目前國內外尚缺乏TNF-α拮抗劑聯合激素及環磷酰胺治療RA-ILD的研究。因此，本研究旨在探究TNF-α拮抗劑聯合激素及環磷酰胺治療RA-ILD的效果，為提高傳統免疫抑制劑的治療效果提供新的方向。

1 對象與方法

1.1研究對象:收集了廈門醫學院附屬第二醫院門診和住院治療的單純類風濕關節炎患者58例(命名為RA-NILD組)、合并間質性肺病的類風濕關節炎患者30例(命名為RA-ILD組)。RA-NILD組男性15例，女性43例，年齡范圍25～84歲，平均年齡57.35±14.21歲。RA-ILD組男性8例，女性22例，年齡范圍30～83歲，平均年齡60.13±13.46歲。納入標準:①RA的診斷均符合2009年美國風濕病協會(ACR)修訂的RA診斷標準;②間質性肺疾病的診斷均符合2000年美國胸科協會/歐洲呼吸協會(ATS/ERS)提出的診斷標準，所有人選患者均為初次診斷RA-ILD，停用糖皮質激素及免疫抑制劑半年以上，無生物制劑的使用史。③所有患者均知情并同意本次研究。排除合并其他肺疾病的患者，如肺部感染、肺結核、慢性阻塞性肺部疾病、支氣管擴張、肺部腫瘤、塵肺、吸入性有機物引起的肺間質疾病；排除存在心功能不全和其他結締組織疾病的患者。

1.2檢測方法:治療前采集患者空腹靜脈血10mL，采用魏氏法檢測紅細胞沉降率(ESR)。通過離心分離出血清，檢測血清中C3、C4、CCP-Ab、CRP、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12、IL-13、IL-17、KL-6、MCP-1、RF、TGF-β和TNF-α的含量。如表1所示，按照商家說明書采用相應的試劑盒檢測相應的指標。

表1 試劑信息

1.3治療分組:將RA-ILD隨機分為兩組，THC組和HC組。THC組的患者皮下注射阿達木單抗(Vetter Pharma-Fertigung Gmbh & Co.KG，88212 拉芬斯堡，德國)40mg/次，半個月一次或戈利木單抗(Baxter Pharmaceutical Solutions LLC，布盧明頓，印第安納州47403，美國)50mg/次，每月一次；靜脈注射環磷酰胺0.4g/次，每兩周一次；口服潑尼松5-10mg/次，每天一次。HC組的患者靜脈注射環磷酰胺0.4g/次，每兩周一次；口服潑尼松5-10mg/次，每天一次。治療24周后，采集患者的空腹靜脈血10mL，按以上描述檢測TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量，統計這些指標的轉陰率。陰性判斷標準：CCP-Ab<20U/mL，TNF-α<4.6μg/L，IL-17<20.6pg/mL，MCP-1<108pg/mL，KL-6<500U/mL，IL-2<5.71pg/mL，985.5pg/mL

1.4統計學分析:應用SAS9.2進行統計學分析，差異性比較利用配對非參數檢驗進行。

2 結 果

2.1RA-ILD患者血清中TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量更高。為了探究RA-NILD與RA-ILD之間細胞因子表達的差異，治療前，我們比較了兩組患者血清中C3、C4、CCP-Ab、CRP、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12、IL-13、IL-17、KL-6、MCP-1、RF、TGF-β和TNF-α的含量。結果顯示，與RA-NILD組相比，RA-ILD組的TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量明顯更高(見圖1。細胞因子包括：ESR(A圖)、C4(B圖)，CCP-Ab(C圖)，CRP(D圖)，C3(E圖)，IFN-γ(F圖)，IL-2(G圖)，IL-4(H圖)，IL-12(I圖)，IL-13(J圖)，IL-17(K圖)，KL-6(L圖)，RF(M圖)，MCP-1(N圖)，TGF-β(O圖)和TNF-α(P圖))。所以，后續實驗中，我們選擇檢測血清中TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量。

圖1 治療前RA-NILD和RA-ILD患者的ESR(A圖)和血清細胞因子(B-P圖)水平比較

2.2TNF-α拮抗劑能顯著優化激素+環磷酰胺的治療效果:為了探究TNF-α拮抗劑對RA-ILD的治療效果，我們將RA-ILD患者分為兩組：生物制劑組(THC組)和免疫抑制劑組(HC組)。治療前，兩組的TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1含量差異不顯著(見圖2。細胞因子包括：CCP-Ab(A圖)、IL-2(B圖)、IL-17(C圖)、KL-6(D圖)、MCP-1(E圖)、TGF-β(F圖)、TNF-α(G圖))。生物制劑組給予TNF-α拮抗劑(阿達木單抗或戈利木單抗)、激素和環磷酰胺進行治療，免疫抑制劑組給予激素和環磷酰胺進行治療，結果顯示，生物制劑組的TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的轉陰率明顯高于免疫抑制劑組(見圖2H)。這些結果揭示TNF-α拮抗劑能顯著優化激素聯合環磷酰胺的治療效果。

圖2 治療前THC組和HC組RA-ILD患者的血清細胞因子水平比較(A-G圖)及治療后血清細胞因子的陰性轉化率比較(H圖)

3 討 論

RA-ILD目前治療措施主要是糖皮質激素和其他免疫抑制劑，但療效有限，死亡率居高不下，同時免疫抑制劑使用時間長容易導致肝腎功能損害等副作用，目前治療RA-ILD仍然是一大難題。因此研究安全、有效的治療RA-ILD的新方法和技術已迫在眉睫。基于肺纖維化是多因素共同參與，研究多通道、多靶點的治療新藥是有價值的探索。本研究通過利用TNF-α拮抗劑聯合激素和環磷酰胺治療RA-ILD患者，發現該治療方法能使患者血清中的TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量轉陰，且其轉陰率顯著高于激素聯合環磷酰胺的治療。

TNF-α是一種來源于單核吞噬細胞的對于炎癥反應具有多效性的細胞因子，它可以通過促進肺泡Ⅱ細胞的凋亡來抑制損傷的肺組織的修復過程，通過與其他因子和細胞相互作用參與肺纖維化的發病過程，在肺間質纖維化發病機制中起著重要作用[9]。TNF-α的拮抗劑有以戈利木單抗和阿達木單抗為代表的全人源化抗體[10]。戈利木單抗是轉基因小鼠技術產生的全人源單抗，阿達木單抗是噬菌體展示技術產生的全人源單抗，免疫原性低，產生抗抗體的發生率均比其他TNF-α拮抗劑低，因此治療效果好[8]。除此之外，該藥依從性高于其他TNF-α拮抗劑[11]。在本研究中，通過比較RA-NILD和RA-ILD患者血清中的TNF-α含量，發現RA-ILD患者血清中的含量明顯高于RA-NILD患者。另外，抑制TNF-α能有效緩解RA病情[12]。因此，TNF-α拮抗劑不僅能減緩肺間質纖維化還能治療RA。

另外，涎液化糖鏈抗原(Krebs von den Lungen-6，KL-6)是肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌的一種大分子唾液酸糖蛋白，在正常的肺泡上皮細胞表面表達量少。受損的Ⅱ型肺泡上皮細胞在損傷和再生過程中分泌大量KL-6，而KL-6誘導成纖維細胞聚集，并對成纖維細胞有著抑制凋亡及促進增殖的作用，從而促進肺纖維化形成[13]。血清KL-6水平升高可能反應Ⅱ型肺泡上皮細胞受損和再生，已發現多種肺部疾病均會出現血清KL-6水平增高，在RA、系統性硬化癥等多種結締組織病合并的間質性肺病中的表達亦明顯升高，且與疾病的嚴重性相關，并有研究提出血清KL-6水平可以作為ILD早期檢測的生物標志物[14,15]。與之相一致的是，我們發現RA-ILD患者的KL-6水平明顯高于RA-NILD患者的KL-6的水平。而經過TNF-α拮抗劑聯合激素和環磷酰胺治療后，KL-6水平明顯降低。

總之，本研究發現RA-ILD患者血清中TGF-β、TNF-α、CCP-Ab、IL-2、IL-17、KL-6和MCP-1的含量明顯更高，發現各項指標與RA-ILD的發病關系。目前，傳統的免疫抑制劑治療RA-ILD的效果欠佳，我們發現聯合TNF-α拮抗劑治療RA-ILD能有效的提高療效，這為治療RA-ILD患者提供新的治療方向。不過，TNF-α拮抗劑優化激素聯合環磷酰胺療效的分子機制還有待臨床大樣本研究進一步探索。