尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2作為大腸癌潛在生物標(biāo)志物的價(jià)值研究

譚振剛 張華清 于建宇

大腸癌（Colorectal cancer，CRC）是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因之一[1]。雖然近年來(lái)新的CRC治療手段不斷出現(xiàn)，但預(yù)后仍不理想[2，3]。有研究發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物在CRC 預(yù)后評(píng)估等方面具有重要作用，在CRC 的分子亞型、DNA 甲基化及機(jī)制調(diào)控等研究中鑒定出許多CRC 的潛在生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物可用于CRC 的早期診斷、治療方案選擇和預(yù)后評(píng)估[4，5]。因此探討新的CRC 生物標(biāo)志物具有重要價(jià)值。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2（Caudal- type homeobox transcription factor 2，CDX2）參與調(diào)節(jié)多種腸道基因表達(dá)以及腸道細(xì)胞的增殖分化[6]，此外作為CRC 的抑癌基因在CRC 組織中表達(dá)下調(diào)[7]。多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)CDX2 與CRC 的進(jìn)展有關(guān)，其低表達(dá)水平與腫瘤晚期、血管浸潤(rùn)和腫瘤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[8～10]。另外，Hinoi 等[11]研究結(jié)果表明，CDX2 的沉默會(huì)導(dǎo)致某些CRC 的表型改變。有研究認(rèn)為CDX2可 作為CRC 的一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物[12，13]。Dalerba 等[14]研究顯示，缺失CDX2 的腫瘤患者生存不佳，且CDX2 陰性的CRC 患者更能從化療中受益，特別是Ⅱ期患者。上述研究說(shuō)明CDX2 與CRC的發(fā)展和預(yù)后關(guān)系十分密切，有可能作為CRC 的生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。本研究選擇96 例CRC 患者臨床資料及組織樣本，比較CDX2 表達(dá)水平在CRC組織與正常癌旁組織之間的差異，隨訪(fǎng)并統(tǒng)計(jì)不同CDX2 表達(dá)水平CRC 患者的生存情況，分析CDX2對(duì)于CRC 的診斷和預(yù)后評(píng)估價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2017年7月～2019年3月在我院就診的96 例CRC 患者臨床資料和組織樣本，男55 例，女41 例，年齡43～81 歲，平均（54.81±9.34）歲；腫瘤部位：左半結(jié)腸、直腸56 例，右半結(jié)腸40 例；病理分期：pT1、pT2、pT3、pT4 期分別為18、27、26、25 例，pN0、pN1～2 期分別為34、62 例，pM0、pM1 期分別為73、23 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為CRC；②臨床資料完整；③預(yù)計(jì)生存時(shí)間＞3 個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前接受過(guò)治療；②合并其他惡性腫瘤；③伴有心、肝、腎等重要器官功能障礙；④臨床資料不完整。本研究已通過(guò)我院倫理委員會(huì)審批。

1.2 提取總RNA切除多余石蠟，將組織切碎放入預(yù)冷的研缽中，加入少量液氮后迅速研磨，待組織變軟，再次加入少量液氮，研磨。重復(fù)操作至組織研磨成粉狀后加入Trizol 試劑（Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）孵育5min，12 000r/min離心5min，棄沉淀。按每1ml Trizol 試劑加入0.2ml氯仿，孵育2～3min。在4℃下12 000g 離心15min，吸取水相，用異丙醇提取RNA。

1.3 cDNA 合成根據(jù)高容量cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，通過(guò)10×RT Buffer（1ml）、25×dNTP Mix（100mM，0.2ml）、RNase 抑制劑（20U/μl，2×0.1ml）和Multi Scribe 逆轉(zhuǎn)錄酶（50U/μl，0.2ml）制備RT 預(yù)混液，最終體積調(diào)節(jié)至20μl，輕輕混勻。首先在室溫下進(jìn)行10min，然后在37℃下進(jìn)行2h，在85℃下孵育5min，反應(yīng)結(jié)束后置于冰上保存至后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR 檢測(cè)根據(jù)Fast SYBR? Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific）制備預(yù)混液，在Light-Cycler 480 系統(tǒng)（Roche，Basel，Switzerland）中進(jìn)行檢測(cè)。PCR 循環(huán)條件：95℃變性10s，55℃退火10s，72℃延伸8s。GAPDH 作為mRNA 測(cè)定的內(nèi)部對(duì)照，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用2-ΔΔCt方法分析。

表1 引物序列

1.5 隨訪(fǎng)治療后對(duì)所有患者進(jìn)行定期隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)時(shí)間截至2020年7月。根據(jù)CRC 患者癌組織中CDX2 的中位水平，將患者分為CDX2 高表達(dá)組（癌組織的CDX2 水平高于中位數(shù)）和CDX2 低表達(dá)組（癌組織的CDX2 水平低于中位數(shù)）。基于患者的生存情況，按照無(wú)進(jìn)展生存期（Progression free survival，PFS）和總生存期（Overall survival，OS）分別繪制不同CDX2 表達(dá)水平CRC 患者的生存曲線(xiàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 8.3 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用例（率）表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用ROC 曲線(xiàn)評(píng)估CDX2 對(duì)CRC的診斷價(jià)值，ROC 曲線(xiàn)下面積（Area under the curve，AUC）越接近于1，代表CDX2 診斷價(jià)值越高。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，log-rank test 用于檢驗(yàn)組間生存的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDX2 在CRC 組織和正常癌旁組織中的表達(dá)CRC 組織與正常癌旁組織中CDX2 表達(dá)水平分別為0.360±0.108、0.744±0.144，CDX2在CRC組織中表達(dá)水平明顯下降，其中有6 例（6.25%）患者CDX2表達(dá)缺失，CRC 組織與正常癌旁組織中CDX2 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）。

2.2 CDX2 對(duì)CRC 的診斷價(jià)值利用ROC 曲線(xiàn)評(píng)估CDX2 對(duì)CRC 的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示AUC=0.969，敏感度為95.00%，特異度為92.00%，見(jiàn)圖1。

圖1 CDX2 診斷CRC 的ROC 曲線(xiàn)

2.3 CDX2 對(duì)CRC 的預(yù)后評(píng)估價(jià)值CDX2 高表達(dá)組和低表達(dá)組患者腫瘤分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組患者臨床資料比較見(jiàn)表2。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，不同CDX2 表達(dá)水平CRC 患者OS 和PFS 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.043、0.027），見(jiàn)圖2、3。CDX2 低表達(dá)患者OS 為（21.72±2.09）個(gè)月，PFS 為（20.02±2.04）個(gè)月；CDX2 高表達(dá)患者OS 為（27.86±1.84）個(gè)月，PFS 為（26.69±1.91）個(gè)月。

表2 不同CDX2 表達(dá)水平CRC 患者一般資料比較

圖2 CDX2 高表達(dá)組和低表達(dá)組OS 生存曲線(xiàn)

圖3 CDX2 高表達(dá)組和低表達(dá)組PFS 生存曲線(xiàn)

3 討論

作為一種腸特異性核轉(zhuǎn)錄因子，CDX2 調(diào)節(jié)并維持著腸上皮細(xì)胞增殖與分化之間的平衡[7]，因此CRC 的生物學(xué)機(jī)制與其表達(dá)異常密切相關(guān)[10]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)CDX2 在CRC 預(yù)后評(píng)估方面具有潛在價(jià)值[12]。Kim 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在CRC 中CDX2 的表達(dá)被腫瘤壞死因子α下調(diào)，CDX2 的表達(dá)水平相比正常細(xì)胞明顯降低。本研究通過(guò)qRTPCR 檢測(cè)CRC 組織與正常癌旁組織中CDX2 的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)CDX2 在CRC 組織中的表達(dá)水平明顯低于正常組織，且ROC 曲線(xiàn)結(jié)果顯示CDX2 對(duì)CRC 診斷的靈敏度和特異度較高，且不同CDX2表達(dá)水平的CRC 患者生存率存在顯著差異，提示CDX2 可作為CRC 臨床生物標(biāo)志物。

相關(guān)研究中CDX2 較少用于診斷CRC，可能是由于目前臨床診斷CRC 的方法（直腸指檢、大便隱血試驗(yàn)和直腸鏡檢查）已較為簡(jiǎn)易方便[16]，但CRC預(yù)后評(píng)估方面尚無(wú)成熟的方法，因此本研究根據(jù)96 例CRC 患者的隨訪(fǎng)情況，進(jìn)一步分析CDX2 對(duì)CRC 是否具有預(yù)后評(píng)估價(jià)值。

對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪(fǎng)，并根據(jù)患者CRC 組織中CDX2 的中位水平，將患者分為CDX2 高表達(dá)組和低表達(dá)組，生存分析結(jié)果顯示：在PFS 和OS 中，CDX2 低表達(dá)組患者的1、2、3年存活率均低于CDX2高表達(dá)組患者，且生存曲線(xiàn)存在顯著差異（P=0.043、0.027）。Bae 等[9]研究結(jié)果顯示，42 例CDX2 表達(dá)缺失的患者存活率明顯較低（P＜0.001），且CDX2 表達(dá)缺失是OS[HR=1.72，95%CI（1.04～2.85），P=0.034]和PFS[HR=1.94，95%CI（1.22～3.07），P=0.005]的獨(dú)立影響因素。作為抑癌因子，較高表達(dá)的CDX2 會(huì)抑制CRC 的發(fā)生發(fā)展，緩解CRC 轉(zhuǎn)移的惡性進(jìn)程[8，9]，因而CDX2 表達(dá)水平較高患者其生存率較高，提示CDX2 可用于CRC 預(yù)后評(píng)估。

綜上所述，本研究證實(shí)CDX2 在CRC 組織中表達(dá)下調(diào)，對(duì)CRC 具有較高的診斷價(jià)值，不同CDX2表達(dá)水平CRC 患者生存率差異顯著，CDX2 可能成為CRC 潛在臨床生物標(biāo)志物，為CRC 預(yù)后評(píng)估提供新的參考指標(biāo)。