MR定量磁敏感圖評估大鼠肩胛區棕色脂肪代謝活性的價值*

祝翠玲, 郭義昊, 鐘俏玲, 斯文彬, 蔡子萌, 余琴琴, 余可妍, 馮衍秋, 張曉東△

1南方醫科大學第三附屬醫院、廣東省骨科研究院影像科(廣東廣州 510630)； 南方醫科大學 2生物醫學工程學院， 3基礎醫學院(廣東廣州 510515)

肥胖是一項重大的全球公共衛生問題，過度肥胖將導致糖尿病、血管性疾病、心臟功能障礙或其他代謝相關性疾病[1-2]。棕色脂肪(brown adipose tissue， BAT)在肥胖癥的病因和治療中起作用，因為其線粒體中存在特異性的解偶聯蛋白1(uncoupling protein1，UCP1)，能將呼吸鏈與ATP合成解偶聯，消耗脂質或葡萄糖釋放熱量，從而改善糖、脂代謝，預防肥胖的發生，因此準確檢測及定量分析未激活與激活狀態的BAT對治療肥胖等代謝性疾病具有重要意義。通過暴露于寒冷環境中來刺激嚙齒類動物肩胛區的BAT促進非顫抖性產熱反應被認為是降低三酰甘油和對抗肥胖的一種手段[3]，同時冷刺激也是激活BAT最簡便的一種方法。由于BAT激活后細胞和組織水平會發生一些改變，包括富含鐵的線粒體含量增加、血液灌注的增加以及脂質的減少[4]， 因此可利用這些特性對BAT進行定量分析，脂肪分數(fat fraction，FF)和R2*(1/T2*)最常應用于脂肪的定量分析。這些定量指標雖然應用廣泛，但仍存在許多不足，尋找一種準確有效且能反映BAT代謝活性的方法至關重要。定量磁敏感圖(QSM)可定量檢測組織磁化率的變化，QSM計算所得的磁化率數值能反應組織在磁場中被磁化的程度，且對組織鐵含量變化比較敏感[5-7]。但目前使用QSM來定量檢測BAT的代謝活性鮮有報道。2019年3—12月，本研究基于BAT代謝活性的變化可引起QSM值的改變，初步探討QSM值定量評估活體大鼠BAT代謝活性的可行性，為肥胖及其代謝相關性疾病的診療提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性，6周齡，體重200～250 g)，購于南方醫科大學實驗動物中心。實驗動物的使用獲得南方醫科大學動物實驗倫理會批準。

1.2 冷刺激組與對照組 待大鼠適應環境1周(自由飲水飲食，動物房內溫度(23±2)℃，晝夜節律為12 h/12 h)后，按照隨機原則將大鼠隨機分為冷刺激組和對照組。冷刺激組：5只SD大鼠獨立裝入鼠籠內，暴露于低溫實驗冷柜中(海爾，中國)，冷柜內溫度4℃，暴露12 h。另外5只對照組大鼠在動物房內飼養。在冷暴露過程中，所有大鼠禁食、禁水。

1.3 磁共振掃描 采用7.0T Bruker小動物磁共振成像設備，使用具有以下參數的4通道頭線圈的三維多回波梯度回波序列：TR=50 ms；TE1/ΔTE/#TE=1.7 ms/1.3 ms/10；矩陣大小=[90×90×60]；體素大小=[0.4 mm×0.4 mm×0.4 mm]，翻轉角度=[20°]。采用呼吸門控并使用同相回波(第2、第5、第8回波)計算初始R2*圖和場圖。然后利用R2*-IDEAL序列所得到的R2*圖和場圖初始化，利用所有的回波得到水圖、脂肪圖、R2*圖和場圖。QSM重建使用Matlab軟件包對采集到的數據進行后處理，首先對場圖解纏繞,然后利用去除背景場和偶極子反演技術，由最終的場圖計算得到。

1.4 勾選感興趣區(ROIs) 采用ITK-SNAP軟件選取3D ROIs，BAT的ROIs是在大鼠肩胛區的FF圖上手動繪制的，避開周圍的血管，從最大層面開始依次勾畫3層，然后將其應用在QSM圖、R2*圖中。計算出定義在ROIs內QSM值(ppb)和R2*值(s-1)的平均值。

1.5 組織取材及處理 MRI掃描結束后，立即采用頸椎脫位法處死實驗動物，將每只小鼠背側朝上，用剪刀從背側向頸部剪開，小心地提起皮膚，向左右前肢各開1個切口，仔細的切開皮膚并分離出BAT；一部分組織立即冷凍在液氮中，隨即轉移到-80℃冰箱中保存備用；一部分組織用4%多聚甲醛(PFA)在4℃固定24 h，石蠟包埋樣本后續制備病理切片。

1.6 免疫組織化學檢測大鼠BAT UCP-1蛋白的表達 從-4℃冰箱中取出切片，室溫放置1 h，放入烤箱(65℃)中烤片1 h，然后進行脫蠟水化，PBS清洗3次；將切片置于已經煮沸的枸櫞酸鈉中高火過夜，修復抗原，PBS洗滌，使用免疫組化筆畫圈防止液體外溢；滴加3%的過氧化氫避光封閉，PBS洗滌3次； 5%(v/v)山羊血清室溫封閉30 min；甩掉玻片上殘余的液體，滴加稀釋的一抗(兔抗鼠UCP-1)孵育，4℃過夜；次日除去玻片上的一抗液體，使用PBS清洗，滴加羊抗兔IgG二抗，37℃孵育1 h；PBS洗3次，滴加辣根酶標記的工作液孵育15 min，使用PBS洗3次；弱光下進行室溫DAB顯色，使用顯微鏡來控制顯色程度，純水輕輕沖洗，用蘇木素復染然后在分化液中返藍；使用不同濃度梯度的乙醇進行脫水，然后二甲苯透明和中性樹膠封片。采用Image Pro Plus6.0軟件在400倍圖片上隨意選擇5個區域測量光密度(IOD)，然后取平均值，最后對結果進行半定量分析。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.3軟件，首先對冷刺激組(n=5)與對照組(n=5)的QSM值、R2*值和UCP-1半定量值分別進行檢驗以驗證數據是否符合正態分布，再進行獨立樣本t檢驗。所有數據均以均數±標準差表示，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 影像學表現 對照組與冷刺激組的FF圖、QSM圖、R2*圖分別見圖1、2，FF圖中紅箭頭及QSM圖中藍色輪廓顯示大鼠肩胛區BAT，R2*圖顯示BAT輪廓不如QSM圖。在FF圖及R2*圖中，冷刺激組相對于對照組的BAT信號暗一些。在QSM偽彩圖中，可以看到對照組BAT為黃色，冷刺激組BAT為青色，提示QSM值的降低，這與我們定量測量的結果一致。

圖1 對照組的FF圖、QSM圖及R2*圖

圖2 冷刺激組的FF圖、QSM圖及R2*圖

2.2 不同組間磁共振參數數值比較 冷刺激組的R2*值、QSM值明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 不同組間各參數測量結果比較

2.3 免疫組化染色結果 冷刺激組可見大量陽性表達顆粒，對照組可見弱陽性，見圖3。UCP-1在對照組和冷刺激條件下均可見到高密度的胞質染色，部分由于冷刺激的BAT中脂質含量明顯降低，使總胞質UCP-1含量有所升高所致。對照組的UCP-1半定量值為478.46±446.14，冷刺激組為1 762.15±1 005.74，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖3 兩組的UCP-1免疫組織化學染色圖(×200)

3 討論

QSM能夠較準確、真實地反映組織磁化率的空間分布情況，已經很好地應用于量化大腦和肝臟內的鐵沉積[8-10]、鑒別鈣化和出血[11]以及評估脊柱的骨質疏松[12]。QSM值的變化受順磁性物質鐵的積累、順磁離子氧化態和抗磁性物質的共同影響。在本項研究中，我們根據MR定量參數(QSM值、R2*值)的差異區分BAT的代謝狀態，并結合組織學分析來評估QSM作為這些過程的潛在生物標記的可能性。

BAT的數量增多或活性增加是治療肥胖、糖尿病等代謝性疾病的關鍵因素。然而，BAT在人體內數量有限且分散，因此BAT代謝活性的測定至關重要。BAT中存在大量富含鐵的線粒體，鐵是人體內非常重要的一種微量元素，在機體的氧氣運輸和細胞的有氧代謝過程發揮著巨大作用，鐵亦是構成電子傳遞鏈的線粒體內膜復合物的基本成分，因此在能量代謝中是必需的。已知將實驗動物置于低溫環境中將導致BAT的細胞和組織發生改變，激活后的BAT代謝活性增加，脂肪含量降低、線粒體內鐵含量及耗氧量增加(脫氧血紅蛋白)[13-15]，因此先前很多研究者利用這些生理特性，多采用通過測量FF和R2*(1/T2*)的方法來定量BAT，但由于肩胛區BAT和白色脂肪常常混合存在，FF體現的可能是兩者混合的脂肪區域的總體脂肪分數，且相對脂肪細胞本身的大小MR所用體素大的原因，僅用BAT的FF作為絕對或者單一評估BAT代謝活性的指標是不準確的；另一種磁共振參數是R2*，該參數對鐵的存在也很敏感，然而在磁化率差異較大的組織界面(如空氣與軟組織、顱底骨氣交界處)以及一些微觀結構的檢測時，R2*受影響較大，R2*亦與磁場強度有關，在高場強下信號衰減快，因此會導致測量不準確。有學者[16]利用R2*對人體鎖骨上區域BAT的代謝活性進行評估，發現R2*不僅受到線粒體中鐵的影響，而且還受到組織灌注變化的影響，R2*值在這個過程中是動態變化的[17]，而且可重復性差，因此R2*的測量可能不足以準確地可靠地量化BAT的代謝活性。

在這項研究中，我們采用單次3D多回波梯度回波序列(mGRE)提取定量參數圖R2*并利用去除背景場和偶極子反演技術，從B0場計算出QSM，大大縮短了掃描時間并減少由此產生的運動偽影。我們在BAT是否接受冷刺激的狀態下，使用QSM來對其進行測量和量化，為了激活BAT，我們將實驗動物暴露在4℃寒冷環境下12 h。本組資料結果顯示，在冷刺激條件下，BAT的QSM值、R2*值均低于對照組，與Ghassaban等[18]的研究中鐵含量的增加導致QSM值增加不一致，可能因為在這個過程中鐵的變化不明顯而脂肪含量變化顯著。已有研究表明，冷刺激后的BAT脂肪含量較低，水分含量相對較高[19-20]，而脂肪作為一種額外的化學物質相對于水來說具有順磁性[21]而影響對組織磁化率的精確估計。本研究中冷刺激組由于脂肪含量明顯降低導致順磁性物質減少，而線粒體中順磁性的鐵含量增加不足以補償脂肪減少所產生的效應，因此QSM值、R2*值較對照組減小；另一方面我們無法保證實驗動物在MR掃描期間繼續暴露在低溫下，溫度的變化可能會影響BAT血流動力學的改變，使組織的磁化率發生變化，尚需要進一步深入研究。

此外，本研究的免疫組化UCP-1半定量分析結果顯示，冷刺激組UCP1蛋白表達較對照組增加，與以往文獻[13，22]結果一致，說明UCP-1的含量與其代謝活性關系密切；兩組之間統計學結果有差異，但差異不夠顯著提示本研究中BAT可能尚未完全激活，且在MR掃描過程中沒有對環境溫度加以控制。然而，不管BAT有沒有接受冷刺激均表達UCP1蛋白，因此我們使用免疫組化染色對該蛋白進行分析，結果兩組均可見到胞質陽性染色顆粒，證明我們評估的是真正的BAT。我們認為UCP-1蛋白水平在不同冷刺激方案的變化與BAT的激活狀態有關，在未來的研究中，可以設計慢性間歇冷刺激[23]對暴露在較長時間的寒冷環境中的多參數指標進行動態測量以求得更準確的數據。

在我們的研究中可以看到QSM圖顯示BAT的區域較R2*圖清晰，QSM值的組間差異性比較也較R2*值大，QSM受微觀磁化率分布的影響較小，對脂肪和鐵含量的變化比較敏感，克服了磁場分布的不均勻性并提供定量和局部解剖學對比，在評估BAT的代謝活性方面較R2*優越。以往多個研究亦表明QSM比R2*定量分析鐵更可靠[6，24]。

本研究存在一些局限性：(1)本次數據的樣本量，可能會影響統計檢驗的強度和對結果的合理解釋。因此，結果仍需要更大的樣本量來進一步確認；(2)ROI放置位置及大小、形態的選擇可能會對結果造成一定影響；(3)急性冷刺激激活BAT可能不如間歇性冷刺激有效，利用間歇性冷刺激可能有助于區分鐵對磁化率的貢獻；(4)沒有測量組織中鐵的含量，不能從生理學角度對BAT進一步分析；(5)本研究僅限于組間比較，并未探究縱向動物活體成像潛能，未來的研究將集中于縱向測量單個動物活體成像變化的能力，并做好重復性驗證。

綜上所述，利用單個三維多回波梯度回波序列得到QSM來評估不同代謝狀態下的BAT代謝活性是可行的，提示QSM值可以作為一個非常有潛力的研究BAT的生物學標記。QSM不僅能夠對BAT進行定量，還能夠識別在R2*圖上部分不明顯的BAT區域的輪廓。因此，可以預期QSM有可能作為一種新的非侵入性工具來評估伴隨著代謝活性改變的BAT。