泛素特異性蛋白酶10在低氧性肺動脈高壓中的表達及對USP10-AMPK信號通路的調控作用*

岳珍珍, 郭森, 焦義明

1鄭州大學第一附屬醫院鄭東院區心臟重癥監護病房(河南鄭州 450052)； 2鄭州大學第一附屬醫院心血管內科(河南鄭州 450000)； 3鄭州大學第二附屬醫院體檢科(河南鄭州 450014)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PAH)是以肺動脈壓力增高、伴或不伴有肺小動脈病變的一種血流動力學和病理生理狀態，可引起肺循環淤阻及右心衰竭，是各種肺源性心臟病和高山性心臟病的重要發病環節和致死原因，具有較高的致殘、致死率[1-2]。了解PAH的發生機制，對于制定有效的防治措施，降低PAH病殘、病死率有重要意義。泛素特異性蛋白酶10(ubiquitin-specific protease 10，USP10)能調節細胞的生長周期，通過多種途徑調控細胞的生理病理變化[3]。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是機體重要的能量代謝受體。研究顯示[4-5]，USP10可特異性地去除AMPKα的泛素化，引起AMPK的不當激活和多種代謝缺陷，AMPK/磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(prtein kinase B，Akt)途徑是包括PAH在內的多種心血管疾病的調控途徑。既往對于USP10的研究多與癌癥相關，關于USP10在PAH中的研究尚少。為此，本研究2018年9月至2019年2月對USP10在低氧性PAH中表達的意義及對USP10-AMPK信號通路的調控作用進行探討，以期為PAH的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠，雄性，40只，6～8周齡，體重200～220 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，許可證號SCXK(粵)2018-0034。

1.2 藥物、試劑及儀器 USP10基因短發夾結構RNA慢病毒載體構建(上海吉凱基因化學技術有限公司)，水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)，肝素鈉(常州千紅生化制藥股份有限公司)，USP10鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK、磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K、磷酸化Akt(p-Akt)/Akt、磷酸化eNOS(p-eNOS)/內皮細胞型一氧化氮合成酶(endothelialnitric oxide synthase，eNOS)抗體(美國BD公司)，逆轉錄試劑盒(日本Takara公司)，BCA蛋白定量試劑盒(上海如吉生物科技發展有限公司)，辣根過氧化物酶(horseradish Peroxidase，HRP)標記一抗(兔抗鼠)、HRP標記二抗(羊抗兔)、DAB顯色試劑盒(上海聯邁生物工程有限公司)，SP免疫組化試劑盒、蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin HE)染色試劑盒、NanoDrop 2000紫外可見光分光度計(賽默飛世爾科技中國有限公司)，Prism7500實時熒光定量(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國AIB公司)，Elx800酶標儀(美國Bio-Tek公司)，石蠟切片機(德國SLEE公司)，光學顯微鏡(日本NiKon公司)。

1.3 方法

1.3.1 低氧性PAH模型構建與干預 40只大鼠分隨機分為4組，每組10只，分別為對照組、模型組、空載組和沉默組。以3 mL/kg 10%水合氯醛腹腔麻醉后固定于木板，止血鉗牽拉舌尖，暴露聲門，1.5×108TU/100 g量(USP10-lentivirus)分3次，緩慢滴入沉默組大鼠氣管內，1次/d，滴注后向氣道內注入少量空氣并捏住鼻孔，促進大鼠嗆咳使慢病毒流入肺部，空載組以等量的NC-lentivirus滴入，對照組與模型組以等量生理鹽水滴入。滴入完畢待感染宿主3 d后，模型組、空載組和沉默組置于10%氧濃度的缺氧箱中飼養3周，間斷缺氧8 h/d(密切觀察大鼠生存情況，避免因急性缺氧而猝死)，對照組正常環境飼養(正常呼吸室內空氣)，4組大鼠均放于同一房間予以相同飲食飼養。

1.3.2 一般情況觀察及指標測量 觀察4組大鼠干預期間的精神狀態、活動量、毛色、呼吸變化。建模完成后各組大鼠以10%濃度水合氯醛(3 mL/kg)腹腔內麻醉，仰臥固定于木板，分離大鼠右側頸外靜脈，使用1.2-F壓力測定導管，3%肝素鈉沖洗后，從大鼠右側頸外靜脈、右心房、右心室進入肺動脈，取出管芯，連接PowerLab壓力記錄分析系統，測量平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial presure，MPAP)與右心室收縮壓(right ventricular systolic presure，RVSP)。肺動脈壓力測量后，實施氣管插管，扎線固定注射器，右肺以絲線結扎。放血處死大鼠，2 mL 4%多聚甲醛經氣管插管注入固定左肺，結扎左肺后取出，以4%多聚甲醛固定過夜。取出大鼠心臟，PBS緩沖液沖洗干凈，剖開左心房和室間隔，以濾紙吸干后，電子天平分別稱量右心室(right ventricle，RV)和左心室加室間隔(left ventricle pius septum，LV+S)，計算右心肥大指數(right ventricular hypertrophy index，RVHI)，RVHI= [RV/(LV+S)]。

1.3.3 病理學觀察 大鼠肺臟組織標本行石蠟包埋切片，厚度4 μm，常規HE染色，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察肺動脈血管組織病理改變。以圖像采集系統測量肺血管(直徑<300 μm)管壁厚度，計算管壁相對厚度指數(relative thickness index，RTI)，RTI=(1-血管壁內徑/血管外徑)×100%。

1.3.4 肺組織USP10、AMPK、PI3K、Akt、eNOS mRNA相對表達量鑒定 取肺組織90 mg，Trizol法提取總RNA，逆轉錄試劑盒得到cDNA，RT-PCR檢測相關基因的表達水平，Takara SYBR Green熒光定量試劑盒設定反應體系：Master Mix 10 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 10 μL；反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性25 s，60℃退火40 s，60℃延伸50 s，重復45個循環。β-actin為管家基因，2-ΔΔCt為目的基因的相對表達量。每個反應重復3次，取3次結果的平均值。各基因引物序列見表1。

1.3.5 肺組織USP10、AMPK、PI3K、Akt、eNOS蛋白相對表達量鑒定 90 mg肺組織，Western blot法檢測蛋白定量，取50 μg樣本蛋白混合等體積上樣buffer，100℃水浴5 min，離心取上清液，電泳分離后電轉60 min將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，封閉液封閉后于室溫孵育2 h，加入一抗(1∶800)，4℃搖床孵育過夜，TTBS液洗膜3次，二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，漂洗后暗室中曝光，計算肺組織中USP10蛋白相對表達量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值。

1.4 觀察指標 (1)大鼠一般情況觀察；(2)大鼠肺動脈血管組織病理改變；(3)各組MPAP、RVSP、RTI、RVHI對比；(4)各組USP10、AMPK、PI3K、Akt、eNOS mRNA相對表達量對比；(5)各組USP10蛋白相對表達量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值對比。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察 造模期間，沉默組、模型組與空載組較對照組大鼠精神狀態變差，活動量減少，毛發暗淡，口唇、眼眶發紫，呼吸急促，沉默組上述情況更為嚴重。

2.2 大鼠肺動脈血管組織病理改變 鏡下觀察，除對照組外，其余3組血管管壁增厚，管腔變窄，伴有平滑肌和彈力纖維層增厚，沉默組變化更為明顯。見圖1。

注：A：空載組；B：沉默組；C：模型組；D：對照組

2.3 各組MPAP、RVSP、RTI、RVHI對比 各組MPAP、RVSP、RTI、RVHI比較，差異有統計學意義(P<0.05)；模型組、空載組、沉默組的MPAP、RVSP、RTI、RVHI均大于對照組(P<0.05)，沉默組各指標均大于模型組與空載組(P<0.05)，模型組與空載組各指標比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組MPAP、RVSP、RTI、RVHI比較

2.4 各組USP10、AMPK、PI3K、Akt、eNOS mRNA相對表達量對比 各組USP10 mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，其余3組的USP10 mRNA相對表達量均下降(P<0.05)，沉默組均低于模型組與空載組(P<0.05)，模型組與空載組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；各組的AMPK、PI3K、Akt、eNOS mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組USP10、AMPK、PI3K、Akt、eNOS mRNA相對表達量對比

2.5 各組USP10蛋白相對表達量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值對比 各組USP10蛋白相對表達量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，其余3組的USP10蛋白相對表達量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值均下降(P<0.05)，沉默組均低于模型組與空載組(P<0.05)，模型組與空載組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表4。

圖2 各組USP10、p-AMPK、AMPK、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS檢測結果

表4 USP10蛋白相對表達量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS蛋白比值對比

3 討論

肺血管阻力增加、收縮、彈性降低及血液黏稠度增加等情況下可導致肺動脈壓力升高，肺小動脈和肌型小動脈出現解剖學變化，肺血管的順應性下降、心輸出量不足，并引起慢性阻塞性肺氣腫、慢性肺源性心臟病及右心衰竭等并發癥，對機體健康造成嚴重影響[6-7]。PAH是長期慢性積累的綜合征，其病因多樣，發病機制比較復雜，涉及細胞、液體因子及分子遺傳等多個途徑的病理生理過程[8]。研究顯示[9]，肺動脈平滑肌細胞與內皮細胞的過度增殖、凋亡在PAH的發生、發展過程中有重要作用。而USP10參與細胞的分裂、增殖、凋亡等生命周期，并能通過USP10-AMPK信號通路參與心血管疾病的病理過程。因此了解USP10在低氧性PAH中的表達及USP10-AMPK信號通路的調控作用，對于PAH的防治有重要意義。

在細胞內的生理調控機制中，蛋白質的泛素化修飾是基本調控機制，參與某些重要蛋白質的修飾后翻譯、細胞周期DNA的修復、信號轉導、轉錄活化等多種生命進程[10]。泛素化與去泛素化對于維持蛋白質的穩態和細胞存活有重要意義，泛素-蛋白酶途徑是真核細胞內蛋白質降解的重要途徑，對于維持蛋白質的穩態和細胞存活有重要意義，廣泛參與機體的多種代謝活動。USP10是USP家族中的重要成員之一，分子功能為半胱氨酸型內肽酶和泛素巰基酯酶，參與泛素依賴的蛋白質分解代謝及泛素周期的生命過程，能通過本身的去泛素化，調控細胞周期、細胞凋亡、DNA損傷修復、細胞免疫及神經元退化等多種生物學功能[11]。研究顯示[12-13]，USP10的蛋白下調能影響宮頸鱗癌的惡性程度及預后，參與調節肝臟脂肪變性、胰島素抵抗及炎癥反應。彭清等[14]研究證實，包括USP10、USP7等USP家族成員在內的異常表達及活性改變，參與多種疾病及腫瘤的發生發展，可參與上皮細胞-間充質改變，促進肺纖維化的形成。本研究結果中，與模型組和空載組大鼠相比，USP10沉默組大鼠的臨床指征較為顯著，肺血管管壁增厚、管腔變窄，平滑肌和彈力纖維層增厚情況更為嚴重，RTI指數更高，同時，USP10沉默組大鼠MPAP、PVR、RVHI等指標均顯著高于模型組和空載組。以上結果說明沉默USP10可促進低氧性PAH的發展，影響大鼠的心室重構。

低氧性PAH是PAH最常見的類型，研究顯示[15]，早期低氧性肺動脈收縮反應與后期合并肺動脈結構重建是PAH發病的重要環節。長期的低氧條件能影響大鼠肺微血管內皮細胞生成一氧化氮(nitric oxide，NO)，導致血管內皮舒縮障礙、血管內皮功能損傷，進而促進肺動脈血管的重建。eNOS是合成NO的關鍵酶，其活化能促進NO的合成，促進血管的舒張，抑制血管內皮功能失調[16]。AMPK是一種高度保守的細胞能量代謝調控器，由催化亞基(α1、α2、β1、β2)和調節亞基(γ1、γ2、γ3)組成，在各種代謝相關的器官中均有表達，能被機體各種刺激激活，并磷酸化激活大量的下游靶分子，減少三磷酸腺苷的利用，影響細胞內能量代謝。研究顯示[17]，USP10特異性地去除AMPKα的泛素化，促進AMPKα磷酸化，在能量脅迫下，通過AMPK介導的USP10 Ser76磷酸化，增強USP10的活性，USP10與AMPK形成了一個關鍵前饋環路，保證了AMPK激活響應于細胞能量狀態的波動而放大響應細胞能量狀態的波動，因此USP10-AMPK通路的異常可導致AMPK激活不正常和多種代謝缺陷。另有研究表明[18]，AMPK信號通路的失調能影響NO的生成，促進內皮功能障礙的發展。PI3K/Akt是具有代表性的增殖、遷移、歸巢相關信號轉導通路，PI3K的激活可誘導Akt的活化其下游信號分子eNOS的絲氨酸磷酸化，促進NO的合成，從而介導內皮細胞的遷移[19]。左曉利等[20]認為，AMPK的活化可磷酸化eNOS Ser1177位點，促進NO的合成與釋放，改善血管內皮功能。AMPK及其下游級聯PI3K-Akt-eNOS對于內皮細胞具有重要的調控作用，內皮細胞通過AMPK/PI3K/Akt/eNOS通路生成NO，維持血管舒張。本研究結果中，與對照組比較，各組的USP10 mRNA、蛋白相對表達量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-eNOS/eNOS蛋白比值均下降；與模型組及空載組比較，沉默組的USP10 mRNA、蛋白相對表達量及p-AMPK/AMPK、p-PI3K/PI3K、p-eNOS/eNOS蛋白比值更低，說明沉默USP10，能抑制AMPK/PI3K/Akt/eNOS信號級聯，促進低氧性PAH的發展。

綜上所述，USP10在低氧性PAH中的表達下調參與病情的進展，其機制可能與抑制AMPK/PI3K/Akt/eNOS信號通路有關。在今后對PAH的基因治療研究中，可考慮從AMPK/PI3K/Akt/eNOS信號級聯激活入手。