姜黃素對腎癌ACHN細胞增殖與凋亡的影響及作用機制*

陳烈鉗, 謝進東, 黃棟強, 陳景宇

惠州市第一人民醫院泌尿外科(廣東惠州 516000)

腎臟腫瘤是泌尿系統主要疾病之一，其中90%是惡性的，又稱為腎細胞癌(RCC)。RCC是成人常見的惡性腫瘤，并且發病率逐年增加[1]。盡管腎癌早期患者通過手術治療后愈后效果較好，但患有復發性或新發轉移性疾病的患者通常無法治愈并且需要全身治療。此外，由于RCC具有多種耐藥基因，使其對放療、化療均不敏感。因此，找到低毒性并具有高效抗癌作用的活性物質成為目前的研究熱點。姜黃素是一種從姜科植物的根莖中提取得到的黃色色素，為酸性多酚類物質，主鏈為不飽和脂族及芳香族基團[2]。研究發現姜黃素可以抗氧化、抑制炎癥反應、抗動脈粥樣硬化、抗類風濕、降脂、抗衰老、消除自由基及抗腫瘤等作用[3]。近年來，越來越多的研究證明，Notch信號通路參與多種腫瘤生物學行為的調控，包括腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡和基因組穩定性。一些研究已經證實，Notch1蛋白及其mRNA在RCC組織中的表達高于鄰近組織[4]。另外有研究表明，姜黃素作用于ACHN細胞后，細胞出現密度降低，細胞形態縮小，變圓等凋亡的特征[5]。因此，我們于2019年3月至2020年12月開展實驗研究姜黃素作用于腎癌ACHN細胞后對其增殖及凋亡的改變，探討其影響凋亡的可能機制，為腎癌治療的新方向提供依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料 腎癌ACHN細胞購自上海生物化學與細胞生物學研究所，由本實驗室傳代培養和凍存。姜黃素購自碧云天生物公司，溶解于二甲基亞砜(DMSO)；MEM培養基及胎牛血清購自美國Gibgo公司; Cell Counting Kit-8試劑盒購自日本Dojindo公司；CO2細胞培養箱購自美國Thermo Scientific公司；流式細胞儀購自美國BD公司；多功能酶標儀購自美國BioTek公司；活性氧檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術所；Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；Bcl-2抗體、Caspase-3抗體及GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞株的培養與傳代 ACHN細胞用含10%胎牛血清的MEM培養基培養，置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中，每2 d更換新鮮培養基，當細胞鋪滿80%培養板以上時利用1%胰蛋白酶進行消化及傳代。

1.2.2 細胞增殖測定 取對數生長期的ACHN細胞，胰酶消化、離心后按照5×103個/孔的細胞密度接種于96孔板，100 μmol/L，四周邊緣用PBS填充，置于恒溫培養箱內孵育24 h后，分別以0、10、20、40、80 μmol/L 姜黃素處理ACHN細胞，每個劑量設5個復孔，同時分別設置溶劑對照組(10、20、40、80 μmol/L姜黃素)及不加細胞和藥物的空白對照組(0 μmol/L)。分別處理12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃避光溫育2 h，全自動酶標儀測量450 nm波長處各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖情況，獨立重復試驗3次。

1.2.3 細胞凋亡測定 取對數生長期的ACHN細胞，胰酶消化、離心后計數，按照5×105個細胞/皿的密度接種細胞至60 mm培養皿中，預培養24 h后分別加入不同濃度(0、20、40、80 μmol/L)的姜黃素繼續培養24 h。預冷PBS小心洗滌2遍，棄上清，按照試劑盒說明加入500 μL的Binding Buffer重懸細胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻；室溫下避光反應10 min后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.2.4 蛋白表達水平檢測 胰酶消化、離心后計數，按照5×105個/皿接種細胞至60 mm培養皿中，預培養24 h，分別加入不同濃度(0、20、40、80 μmol/L)姜黃素，繼續培養24 h后收集處理后的ACHN細胞，預冷的PBS洗滌細胞2次，向離心管中加入 100 μL的細胞裂解液超聲處理，4℃，14 000×g離心10 min；收集上清取5 μL測定其總蛋白濃度，剩余部分按照4∶1比例加入5×SDS，充分混勻，100℃煮沸5 min。配制SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，進行凝膠電泳；電泳后，半濕轉法轉移至PVDF膜上，放入5%的脫脂奶粉，置于搖床上，室溫封閉1 h。以TBST為稀釋液配置一抗(Bcl-2、Caspase-3、GAPDH)，4℃過夜。次日用 0.1% TBST 液洗膜3次，加入相應二抗，置于搖床上，1 h后再次洗膜3次后，鋪于曝光黑板上，將混勻的化學發光底物均勻滴在 PVDF膜上，置于曝光機中進行曝光。觀察結果，每個實驗重復3次。

1.2.5 Real-time PCR測定ACHN細胞中Notch1基因表達量的變化 收取細胞后，用試劑盒提取RNA,并用反轉錄試劑盒聚合為cDNA，以提取的細胞中cDNA位模板，進行qPCR反應，Notch1 F:5′-CCTTTGTGCTTCTGTTCTTCG-3′,Notch1 R:5′-CCACTCATTCTGGTTGTCGTC-3′，212 bp；GAPDH F:5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，GAPDH R:5′-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′，532 bp。反應在羅氏Light Cycler? 480 PCR儀上運行，PCR反應參數: 94℃ 1 min；98℃ 10 s，60℃ 10 min，共30個循環；72℃ 10 min，4℃ forever。

2 結果

2.1 姜黃素對ACHN細胞增殖的影響 姜黃素作用后ACHN細胞增殖速度明顯降低，且抑制作用呈時間及濃度依賴性(P<0.05)，即隨著姜黃素濃度的增加，細胞增殖減慢；在相同濃度的姜黃素作用下，隨著時間延長，細胞抑制率越高。見圖1。

圖1 不同濃度姜黃素對ACHN細胞增殖的影響

2.2 姜黃素對ACHN細胞調亡的影響 隨著姜黃素濃度的增加，凋亡細胞數量占比越多，即姜黃素作用后可促進ACHN細胞的凋亡，且凋亡率呈現出明顯的劑量依賴關系(P<0.01)。見圖2、表1。

表1 不同濃度姜黃素對ACHN細胞凋亡的對比

圖2 不同濃度姜黃素對ACHN細胞凋亡的影響

2.3 姜黃素對ACHN細胞調亡相關蛋白表達的影響 隨著姜黃素濃度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3則表達增加，Notch 1蛋白表達增加。見圖3。

圖3 不同濃度姜黃素處理ACHN細胞24 h后相關蛋白表達水平

2.4 姜黃素對ACHN細胞中Notch1基因表達量的影響 不同濃度不同時間姜黃素作用后ACHN細胞中Notch1基因表達增加，且表達量呈時間及濃度依賴性(P<0.05)，即隨著姜黃素濃度的增加，Notch1基因表達增加；在相同濃度的姜黃素作用下，隨著時間延長，Notch1基因表達增加越多。見圖4。

圖4 不同濃度姜黃素對ACHN細胞Notch1基因表達的影響

3 討論

腎癌是泌尿系統常見腫瘤之一[6]，世界衛生組織(WHO)下屬機構發布的2018年全球腫瘤流行病統計數據(GLOBOCAN 2018)表明腎癌在男性和女性的惡性腫瘤中的排名分別為第6位和第10位，占2018年所有新診斷癌癥的5%和3%[7]。腎癌患者早期無明顯癥狀，大約30%的患者就診時已是轉移性腎癌。研究證實腎癌對化療、放療及激素治療等均不敏感，且治療愈后較差[8]。近年來，越來越多的研究致力于尋找治療腎癌新的有效藥物。

1985年姜黃素首次被發現具有較強的抗腫瘤作用，并引起廣泛關注及研究[9]。姜黃產于東南亞，隸屬于姜科家族，具有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗肝纖維化、調脂和抗動脈粥樣硬化等，且具有毒性低、不良反應少的特點[10]。現代的研究發現姜黃素具有抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡和減少瘤體數量、減慢瘤體增長的作用，從腫瘤發展的多個環節和步驟發揮抗腫瘤效應[11]。

本研究利用CCK-8試劑盒檢測不同濃度姜黃素處理腎癌ACHN細胞不同時間后細胞增殖變化，結果表明姜黃素可以抑制腎癌ACHN細胞的增殖，且抑制作用呈時間及濃度依賴性。利用流式細胞儀檢測發現姜黃素可誘導腎癌ACHN細胞凋亡，同時凋亡率隨姜黃素濃度的增加而上升，該結果表明姜黃素可抑制腎癌ACHN細胞的增殖，并促進該細胞的凋亡，這與既往關于姜黃素對癌細胞的作用的研究[2, 12]結果相一致。

當前，Notch信號轉導途徑是生命科學領域中的熱點問題。在RCC中，Notch1受體蛋白將被重新表達，以增加RCC細胞的增殖。隨著RCC的病理分級，臨床分期和腫瘤的增加，Notch1的表達水平將進一步升高[13]。研究表明，Notch1受體在腫瘤血管中高表達，對腫瘤的增殖有一定的作用[14]。RCC中Notch1信號的異常激活，這種異常激活的Notch1信號蛋白可以通過激活PI3K-Akt和NF-κB信號通路來促進G1-S期RCC細胞增殖和細胞周期進程[15]。

有研究表明，腎臟透明細胞癌中Notch1和Notch信號通路的其他蛋白的陽性表達率研究表明，腎臟透明細胞癌組織中Notch1和Notch信號通路的其他蛋白的陽性表達率高于正常人[16]。腎組織，并與臨床參數如腫瘤的病理分級和大小密切相關，提示Notch1對腎癌具有重要的診斷和預后意義[17]。此外，研究表明，Notch1在腎癌細胞Caki-1和786-0中的表達明顯高于正常腎小管上皮細胞HK-2，并且干擾Notch1的表達可顯著降低Caki-1細胞的生存能力，但具體的作用機制尚無報告[18]。根據張震等[19]的研究結果，Notch1在腎癌細胞中的表達明顯高于HK-2細胞，提示Notch1在腎癌組織中可能具有促癌作用。此外，尚春香等[20]研究表明，下調腎癌細胞Caki-1中Notch1的表達可顯著降低細胞活力并誘導細胞凋亡，細胞癌組織高于正常腎組織，且與臨床參數如腫瘤的病理分級和大小密切相關，提示Notch1對腎癌的診斷和預后意義重大。本研究為探討姜黃素在促進腎癌ACHN細胞凋亡中Notch1基因表達水平改變，Real-time PCR、Western blot檢測結果顯示Notch1基因表達增加，且表達量呈時間及濃度依賴性。

在多細胞生物中，細胞凋亡是發展和維持組織穩態的一個重要的進化保守機制，它在癌細胞中受到干擾。細胞凋亡可導致細胞特性的某些變化，包括活化Caspases、線粒體去極化和DNA斷裂等。

線粒體是細胞呼吸能量中心，也是細胞凋亡的調控中心。線粒體能通過不同的信號轉導方式感受來自細胞內外的刺激，在相關蛋白的調節下，線粒體的膜通透性發生改變，從而釋放出相關的促凋亡因子。Bcl-2 家族蛋白就是其中最為關鍵的一種，該家族蛋白能夠形成同源二聚體或異源二聚體，通常分為兩大類：一類是抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-x)，另一類則是促凋亡蛋白(如Bax、BAK)。而抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比值關系，與細胞線粒體膜通透性的調節具有重要的相關性[21-22]。Caspase 位于細胞質中，可選擇性切割某些蛋白質，其中凋亡相關性 Caspase 包括凋亡效應亞類(如Caspase-3)及凋亡啟動亞類(如Caspase-9)。凋亡過程中引發 Caspase 活化的主要途徑有兩條，包括線粒體調控通路(內源性凋亡)和細胞死亡受體介導通路(外源性凋亡)[23-24]。有學者發現姜黃素可以通過、下調 Bcl-2、上調Bax，繼而影響Bcl-2與Bax的比值，激活Caspase-3的表達，從而誘發腫瘤細胞凋亡的發生[22, 25]。本研究采用Western blot檢測不同濃度姜黃素處理ACHN細胞后Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達改變。實驗結果表明 姜黃素作用于ACHN細胞后，隨著其濃度的增加，凋亡執行蛋白酶Caspase-3表達增加，而抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達減少。研究結果提示姜黃素促進ACHN細胞凋亡可能是通過提高細胞內Notch1基因的表達，增加Bax、Caspase-3的表達，下調Bcl-2蛋白水平來實現的。

綜上所述，姜黃素通過促進ACHN細胞中Notch1基因的表達，上調 Bax、下調 Bcl-2蛋白的表達，從而激活Caspase-3表達，促進ACHN細胞凋亡的發生，因此猜想Notch1基因可以促進ACHN細胞凋亡，而其中詳細的凋亡機制還需進一步研究。