不同分子量的枸杞多糖組分對樹突狀細胞成熟的影響①

陳艷平 廖海鋒王青 羅霞 鄧向亮 周聯（廣州中醫藥大學，廣州 510006）

近年來，多糖的研究逐漸引起重視，其組成較為復雜，分子量可從幾千到幾十萬［1］。目前研究認為，多糖生理功效和生物活性與其分子量大小、聚合度、分支度及溶液中高級構象等有關，多糖分子量太大或太小均會引起其活性下降［2］。多糖的相對分子量越大，體積越大，越不利于多糖跨越多重細胞膜進入生物體內發揮生物學活性，但分子量過低也無法形成產生活性的聚合結構［3］。

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞（Lycium bar-barum L.）的干燥成熟果實，具有滋補肝腎、益精明目的功效，是一種常見的藥食同源的中藥材。現代藥理學研究表明，枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharides，LBPs）是枸杞的主要活性成分，具有增強免疫功能、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗肝損傷、降血糖等多種生物學活性或藥理作用［4‐7］。多項研究表明，LBPs可促進樹突狀細胞（dentritic cells，DCs）的分化和成熟，其活性可能與分子量大小有關［8‐10］。課題組前期試驗采用膜分離技術從枸杞粗多糖中分離得到不同分子量的枸杞多糖組分（LBP2、LBP3、LBP4和LBP5）［11］。本文比較不同分子量的多糖組分促進DCs成熟的差異，篩選出活性最強的組分，為枸杞多糖的進一步研究和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品LBPs組分：不同分子量LBPs組分由廣州澤力生物技術有限公司通過膜透析技術分離純化所得。按照分子量的大小分別為LBP2（分子量350～400 kD，糖66.88%，水12.8%）、LBP3（分子量40～350 kD，糖54.47%，水14.59%）、LBP4（分子量8～40 kD，糖56.53%，水14.88%）、LBP5（分子量3～8 kD，糖55.21%，水15.85%）。

1.1.2 試劑RPMI1640培養基（Gibco公司）；胎牛血清（Biological Industries公司）；Murine GM‐CSF和Murine IL‐4（PerproTech公 司）；PE/Cy7 anti‐mouse CD11c antibody、FITC anti‐mouse CD80 antibody、PE anti‐mouse MHCⅡ（I‐A）、PE/Cy5 anti‐mouse CD86 antibody（eBioscience公司）；脂多糖LPS（Sigma‐Al-drich公司）；Cytometric Bead Array（CBA）Mouse In-flammation Kit（BD公司）。

1.1.3 儀器SW‐CJ‐2FD型超凈工作臺（江蘇蘇凈安泰公司）；L535R型臺式冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；FACSCantoⅡ流式細胞儀（BD公司）；MCO‐20AIC型CO2培養箱（SANYO公司）；BDS 300型倒置生物顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）；Multiskan FC型酶標儀（Thermo公司）。

1.1.4 實驗動物SPF級雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重18～22 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（粵）2013‐0002。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓源DCs的原代培養參照《免疫學技術及其應用》中的培養條件，即10～20 ng/ml GM‐CSF和1 ng/ml IL‐4，本研究初步比較原代細胞培養條件，通過檢測其特異性表型獲得純度最好的未成熟DCs［12］。具體操作過程如下：無菌取C57BL/6小鼠股骨和脛骨，RPMI1640基礎培養基反復沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞置于離心管中。將獲得的骨髓細胞通過400目不銹鋼篩網過濾后，離心（300 g，5 min，4℃），棄上清。加入2 ml紅細胞裂解液，混勻，1 min后離心（300 g，5 min，4℃），棄上清。再用RPMI1640基礎培養基洗滌骨髓細胞2次。設置3個組別的培養條件，分別為A組（GM‐CSF 10 ng/ml，IL‐4 1 ng/ml）、B組（GM‐CSF 20 ng/ml，IL‐4 2 ng/ml）、C組（GM‐CSF 20 ng/ml，IL‐4 1 ng/ml）。將細胞因子溶解于RPMI1640完全培養基并達到設定濃度值，重懸細胞并調整濃度為1×106個/ml，以4 ml/孔接種于6孔培養板，置于細胞培養箱培養。3 d后進行全量換液，補充含特定濃度細胞因子的RPMI1640完全培養基。在第5天到第7天期間，每1～2 d半量換液1次。第8天收集半懸浮細胞，加入CD11c PE/cy7 anti‐mouse抗體。渦旋，常溫下孵育20 min后，流式細胞儀收集1萬個細胞，檢測CD11c陽性細胞的比例進行純度鑒定。

1.2.2 Griess法觀察LBPs不同組分對DCs釋放NO的影響收集1.2.1中A組未成熟的DCs，以含10% FBS的RPMI1640完全培養基重懸細胞，將細胞濃度調整為1×106個/ml接種于96孔板，100μl/孔。分組如下：正常組（Control組）、LPS組（0.1μg/ml），枸杞多糖LBP2、LBP3、LBP4、LBP5組（各組分劑量分別為25、50、100、200μg/ml）。加藥后，將細胞置于細胞培養箱中培養24 h后吸取細胞培養液上清，按NO試劑盒說明書操作，酶標儀測定540 nm波長下OD值。根據標準品擬合出標準曲線，并換算實際的NO濃度值。

1.2.3 CBA法檢測LBPs不同組分對DCs分泌細胞因子的影響DCs在成熟過程中會分泌多種細胞因子，包括IL‐6、IL‐10、MCP‐1、IFN‐γ和TNF‐α等。為了研究LBP2、LBP3、LBP4、LBP5對DCs分泌細胞因子的影響，分別加入25μg/ml的LBPs各組分刺激DCs，24 h后收集培養液上清，另加入濃度為0.1μg/ml的LPS作為對照，根據試劑盒說明書，CBA法檢測培養液上清IL‐6、IL‐10、MCP‐1、IFN‐γ和TNF‐α的濃度。

1.2.4 流式細胞術檢測LBP3對DCs表面分子表達的影響DCs在成熟過程中，會伴隨MHCⅡ、CD40、CD80和CD86等表達升高。LBP3在LBPs幾個組分中表現出最強的誘導DCs成熟的活性。課題組既往研究表明，與其他組分相比，LBP3表現出更強的抗腫瘤及促進巨噬細胞活化作用［11，13］。故本部分對LBP3誘導DCs表型成熟的作用進行驗證。收集1.2.1中A組的未成熟DCs，將細胞濃度調整為2×105個/ml，以0.5 ml/孔接種于24孔板。設置Con-trol組、LPS（0.1 μg/ml）組、LBP3（25、50、100、200μg/ml）組，共6個分組。加藥刺激24 h后，收集DCs至流式管并離心（300 g，5 min，4℃）。添加CD11c PE/cy7 anti‐mouse，MHCⅡPE anti‐mouse，CD80 FITC anti‐mouse，CD86 PE/cy5 anti‐mouse抗體，將抗體與細胞混合渦旋，常溫下孵育20 min。離心，棄上清，400μl PBS渦旋細胞。流式細胞術檢測CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD80+、CD11c+CD86+DCs的表達情況。

1.3 統計學處理采用SPSS18.0統計軟件進行處理，數據以±s表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠骨髓來源DCs的體外誘導及培養由表1可知，小鼠骨髓細胞在A（GM‐CSF 10 ng/ml，IL‐4 1 ng/ml）、B（GM‐CSF 20 ng/ml，IL‐4 2 ng/ml）、C（GM‐CSF 20 ng/ml，IL‐4 1 ng/ml）3種培養條件下均可被誘導為未成熟DCs，A組誘導條件下CD11c+DC的比例高于B組和C組，達到82.1%，故后續研究均采用10 ng/ml GM‐CSF，1 ng/ml IL‐4條件誘導培養未成熟DCs。

顯微鏡下觀察在A組誘導條件下的細胞形態如圖1，自第3天起，細胞開始變得不規則并貼附在培養板底部，細胞集落逐漸形成。至第8天，半懸浮細胞變得更為密集，且細胞較為飽滿，形態不規則，與相關文獻報道的未成熟DC形態相符［13‐14］。

2.2 Griess法檢測LBPs各組分對DCs釋放NO的影響如圖2所示，除LBP2外，LBP3、LBP4、LBP5均可劑量依賴性地促進未成熟DCs釋放NO。與其他3個LBPs組分相比，LBP3刺激DCs釋放NO的能力最強，差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 CBA法檢測枸杞多糖各組分對DCs釋放細胞因子的影響如圖3所示，LBP2的活性較低（P＞0.05）；LBP3和LBP5均可促進DCs分泌IL‐6、IL‐10、MCP‐1、IFN‐γ和TNF‐α（P＜0.05或P＜0.01）；LBP4能促進DCs分泌IL‐6、MCP‐1和TNF‐α（P＜0.01）。此外，對4種多糖組分刺激DCs分泌細胞因子進行比較分析，除LBP3刺激DCs分泌的MCP‐1濃度低于LBP5外（P＜0.01），其他細胞因子濃度均高于另外3種多糖組分。

表1 不同培養條件對CD11+DCs比例的影響（±s，n=3）Tab.1 Proportion of CD11+DCs under different culture conditions（±s，n=3）

表1 不同培養條件對CD11+DCs比例的影響（±s，n=3）Tab.1 Proportion of CD11+DCs under different culture conditions（±s，n=3）

Note：Compared with control group，1）P＜0.001.

圖1 10 ng/ml GM‐CSF聯合1 ng/ml IL‐4誘導未 成熟DCs的細胞形態（×200）Fig.1 Morphology of immature DCs induced by 10 ng/ml GM‐CSF and 1 ng/ml IL‐4（×200）

圖2 LBPs不同分子組分對DCs分泌NO的影響Fig.2 Effects of different LBPs fractions on production of NO in culture supernatants of DCs

圖3 LBPs不同組分對DCs分泌的細胞因子的影響Fig.3 Effects of different LBPs fractions on production of cytokines in culture supernatants of DCs

圖4 LBP3對DCs表面分子表達的影響Fig.4 Effect of LBP3 on cell surface molecule expression on DCs

圖5 LBP3對DCs表面分子MFI的影響Fig.5 Effects of LBP3 on MFI of cell surface molecule in DCs

2.4 流式細胞術檢測LBP3對DCs表面分子表達的影響如圖4所示，LBP3的各劑量均可有效提高CD11c+DCs中MHCⅡ+、CD80+、CD86+表達水平（P＜0.01）；與空白組相比，LBP3刺激后的DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86的 平 均 熒 光 強 度（mean fluorescence intensity，MFI）均顯著增強（P＜0.05或P＜0.01）。見圖5。表明LBP3具有良好的誘導DCs成熟的活性。

3 討論

研究證實，LBPs具有良好的免疫調節和抗腫瘤功能［14‐15］。在課題組前期分離得到的5種不同分子量LBPs組分中，由于LBP1含糖量偏低，且不易溶于水，故本研究只對余下的4種水溶性多糖組分LBP2、LBP3、LBP4和LBP5進行比較。

DCs是機體主要的抗原遞呈細胞之一，通過遞呈抗原激活T細胞，誘導適應性免疫應答。但DCs在體內數量極少，從體內分離DCs耗時較長且細胞產量極低，不利于開展相關研究。利用小鼠骨髓中的前體細胞加外源性細胞因子組合定向誘導培養，是目前體外獲得大量DCs的主要方法，在研究DC的生物學功能方面具有重要的意義［16］。目前體外誘導DCs的培養條件尚無統一標準，本研究結果顯示，10 ng/ml GM‐CSF聯 合1 ng/ml IL‐4是 誘 導CD11c+DCs的最佳條件。

DCs的成熟與否是發揮生理功能的先決條件［17］。未成熟的DCs表面低表達MHCⅡ類分子和共刺激分子，具有較強的抗原攝取和加工能力；成熟的DCs具有較強的抗原遞呈能力，可將抗原信息提呈給T細胞從而誘導T細胞產生特異性免疫應答［18］。有研究報道，在DCs被激活后由未成熟狀態轉變為成熟狀態的過程中，伴隨著NO的釋放及IL‐1β、IL‐6、TNF‐α、IL‐12、IL‐10和MCP‐1等細胞因子的分泌增加［19‐20］。本研究中，經過不同分子量的枸杞多糖組分刺激后，DCs釋放的NO及分泌的IL‐6、IL‐10、MCP‐1、IFN‐γ和TNF‐α含量顯著增加，尤以LBP3作用明顯，以上結果表明LBPs能誘導DCs成熟，且LBP3在這4種組分中活性最強。

成熟的DCs高表達MHCⅡ類分子和共刺激分子［21］。本研究中LBP3促進DCs表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86表達，進一步證實LBP3可促進DCs成熟。

以上研究表明LBPs可明顯促進DCs成熟，且其作用活性與分子量密切相關，以分子量為40～350 kD的LBPs組分（LBP3）為佳，但相關機制尚需進一步研究。