通過MC‐Tryptase‐PAR‐2‐FLS途徑探討資木瓜總苷對K/B×N小鼠血清轉移性關節炎的治療作用①

周婷婷 陳先勇 陳桂婷 曹楠 李世剛（三峽大學醫學院，宜昌 443002）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以滑膜增生、關節軟骨與骨破壞為特征的慢性自身免疫性疾病，全球發病率為0.5%～1.0%，女性發病率是男性的2～4倍［1］。RA作為高致殘性慢性疾病，嚴重影響患者健康和生活質量，具體發病機制尚未明確。

肥大細胞（mast cell，MC）及其相關細胞因子在RA發病機制中的作用是近年研究熱點，研究表明，正常關節中活化的MC約占正常關節滑膜細胞總數的1%～5%，但RA患者滑膜中活化的MC數明顯增多，是正常水平的6～25倍，且增加程度與病情活動度相關，滑膜MC常聚集于血管翳和軟骨交接及血管翳侵入骨皮質處，通過多種途徑引發RA，導致軟骨和骨損害［2］。

資木瓜是鄂西南道地藥材，具有補肝益腎、舒筋活絡、抗炎止痛等作用，主治濕痹拘攣，腰膝關節疼痛，常用于風濕、RA治療［3］。資木瓜總苷（total sa-ponins ofchaenomeles speciosa，TSCS）是資木瓜主要有效成分。本研究采用MC C‐kit基因正常型C57BL/6小鼠和MC C‐kit基因缺陷型KitW‐4Bao小鼠，通過給予KitW‐4Bao小鼠過繼移植正常小鼠的骨髓來源肥大細胞（BMMC），探討TSCS通過抑制MC活化治療K/B×N小鼠血清轉移性關節炎的作用機制［4］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物KRN小鼠，8周齡，雄性，由美國哈佛大學醫學院Mathis D.和Benoist C.教授饋贈。SPF級NOD/Lt J小鼠，8周齡，雌性，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證編號：SCXK（京）2014‐0004。SPF級C57BL/6小鼠，8周齡，雌性，購于湖北省疾控中心，生產許可證編號：SCXK（鄂）2015‐0018。KitW‐4Bao小鼠，8周齡，雌性，購于杭州師范大學實驗動物中心，生產許可證編號：SCXK（浙）2011‐0048。

1.1.2 藥品與試劑D101大孔吸附樹脂分離純化TSCS，含量為51%，臨用時采用雙蒸水配成所需濃度，pH=7.4；小鼠IgG、IL‐6、IL‐17、TPS（Tryptase）、TNF‐α和PGE2ELISA試劑盒（Elabscience公司）；Prime-ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR?Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司）；Anti‐Mast Cell Trypt-ase和Anti‐PAR‐2（Abcam公司）；Trizol Reagent（Invit-roge公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2 方法

1.2.1 K/B×N小鼠血清轉移性關節炎模型構建雄性KRN小鼠與雌性NOD小鼠雜交生產的F1代小鼠即為K/B×N小鼠。采用心臟采血法，離心收集2～6月齡K/B×N小鼠血清。8～12周齡的C57BL/6小鼠和KitW‐4Bao小鼠及移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠，在第0、3天分別尾靜脈注射150μl K/B×N小鼠血清，構建K/B×N小鼠血清轉移性關節炎模型。

1.2.2 分組及給藥方案C57BL/6小鼠分別注射C57BL/6小鼠血清及K/B×N小鼠血清作為正常對照組和模型組，KitW‐4Bao小鼠注射K/B×N小鼠血清作為陰性對照組，移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠隨機分為3組：陽性藥物組、低、高劑量藥物組，均注射K/B×N小鼠血清，每組8只。除正常對照組外，其余各組小鼠均構建K/B×N小鼠血清轉移性關節炎模型。致炎第4天開始給藥，1次/d，共17 d，正常對照組、模型組和陰性對照組給予等體積生理鹽水，低、高劑量藥物組分別灌胃給予60、240 mg/kg TSCS，陽性藥物組腹腔注射25 mg/kg色甘酸鈉，于第20天處死小鼠，取血樣和關節組織。

1.2.3 關節腫脹度及關節炎評分致炎前、致炎后第4、8、12、16、20天，采用游標卡尺測量小鼠足踝關節厚度，根據足踝關節紅腫程度進行評分，評分標準：0分：無紅腫；1分：1個足踝關節紅腫；2分：2個足踝關節紅腫；3分：3個足踝關節紅腫；4分：4個足踝關節紅腫。

1.2.4 關節組織形態學觀察關節組織固定脫鈣，常規石蠟包埋制片，HE染色，光學顯微鏡下觀察組織病理改變。根據關節周圍組織中性粒細胞浸潤（炎癥）程度、邊緣帶血管翳（血管翳）、骨侵蝕及軟骨破壞情況進行評分［5］。

1.2.5 滑膜組織MC及脫顆粒觀察石蠟切片經二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水，甲苯胺藍（TB）染色，光學顯微鏡下觀察MC形態并計數。脫顆粒率（%）=脫顆粒MC數/MC總數×100%。

1.2.6 免疫組化檢測滑膜組織Tryptase、PAR‐2表達石蠟切片經常規脫蠟水化，微波修復抗原，3%H2O2處理滅活內源性過氧化物酶，5% BSA室溫封閉30 min，滴加一抗，4℃孵育過夜，滴加二抗，孵育1 h，DAB顯色，蘇木素染液復染，封片，顯微圖像分析系統定量分析圖像。

1.2.7 血清抗體及關節組織炎癥因子檢測采用ELISA試劑盒檢測血清IgG及關節組織Tryptase、TNF‐α、IL‐6、IL‐17、PGE2含量變化。

1.2.8 qRT‐PCR檢 測 關 節 組 織Tryptase、PAR‐2 mRNA表達取液氮凍存小鼠炎癥足跖關節制備組織勻漿，提取總RNA。采用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，以GAPDH為內參，引物序列見表1，采用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行PCR擴增，檢測Tryptase、PAR‐2 mRNA表達。

1.3 統計學處理采用GraphPad Prism 6.01軟件進行統計學分析。數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠關節腫脹度及關節炎評分與陰性對照組相比，移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠注射K/B×N小鼠血清后出現關節炎癥狀。與模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組小鼠關節腫脹度和關節炎評分明顯降低（P＜0.05），TSCS低劑量組小鼠關節腫脹度及關節炎評分差異無統計學意義（P＞0.05，圖1）。

2.2 各組小鼠關節組織病理變化及評分HE染色結果如圖2所示，與W‐4Bao陰性對照組相比，WT模型組小鼠關節間隙消失，滑膜中有明顯炎癥細胞浸潤，并伴有骨及軟骨破壞；與WT模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組小鼠關節間隙清晰，炎癥細胞浸潤明顯改善，骨及軟骨破壞程度明顯減輕；TSCS低劑量組小鼠關節間隙減小，滑膜中炎癥細胞浸潤程度、骨及軟骨的破壞程度均較WT模型組有所降低。各組病理學評分分析發現，與W‐4Bao陰性對照組相比，WT模型組小鼠各項評分升高；與WT模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組各項評分均顯著降低（P＜0.01），而TSCS低劑量組各項評分變化無統計學意義（P＞0.05，圖3）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

圖1 各組小鼠關節腫脹度及關節炎評分Fig.1 Joint swelling degrees and arthritis scores of mice in each group

圖2 各組小鼠關節組織HE染色（×200）Fig.2 HE staining of joint tissue of mice in each group（×200）

2.3 各組小鼠關節組織肥大細胞脫顆粒變化TB染色結果見圖4，與W‐4Bao陰性對照組相比，WT模型組小鼠關節組織MC脫顆粒數較多，脫顆粒率較高；與WT模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組小鼠關節組織MC脫顆粒數顯著減少，脫顆粒率降低（P＜0.01），TSCS低劑量組小鼠關節組織MC脫顆粒率差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠關節組織病理學評分Fig.3 Histopathological scores of joints of mice in each group

圖4 各組小鼠關節MC脫顆粒情況（×100）Fig.4 Degranulation of joint MC of mice in each group（×100）

圖5 各組小鼠關節組織Tryptase表達（×200）Fig.5 Expression of Tryptase mRNA in joint tissues of mice in each group（×200）

圖6 各組小鼠關節組織PAR‐2表達（×200）Fig.6 Expression of PAR‐2 in joint tissues of mice in each group（×200）

2.4 各組小鼠關節組織Tryptase蛋白和mRNA表達與W‐4Bao陰性對照組相比，WT模型組小鼠關節組織Tryptase蛋白及mRNA表達升高；與WT模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組Tryptase蛋白及mRNA表達降低（P＜0.01），TSCS低劑量組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

2.5 各組小鼠關節組織PAR‐2蛋白和mRNA表達與W‐4Bao陰性對照組相比，WT模型組小鼠關節組織PAR‐2蛋白及mRNA表達升高；與WT模型組相比，TSCS高劑量組、色甘酸鈉治療組小鼠PAR‐2蛋白及mRNA表達降低（P＜0.05），TSCS低劑量組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖7 各組小鼠血清IgG及關節組織炎癥因子水平Fig.7 Levels of serum IgG and joint tissue inflammatory factors of mice in each group

2.6 各組小鼠血清ⅠgG及關節組織炎癥因子水平與W‐4Bao陰性對照組相比，WT模型組小鼠血清中IgG、關節組織Tryptase、IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2含 量升高；與WT模型組相 比，TCSC高 劑量組、色甘酸鈉治療組小鼠血清中IgG、關節組織Tryptase、IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2含量顯著降低（P＜0.05），TSCS低劑量組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖7。

3 討論

K/B×N小鼠關節炎模型作為最常用的基因修飾小鼠模型之一，是RA研究的重要工具。該模型與RA的臨床組織學特征相似，均有白細胞浸潤、滑膜炎、血管翳生成、關節軟骨和骨的破壞等特征，且發病嚴重、迅速，在遺傳背景相同的動物中發病率為100%［6］。K/B×N小鼠來自KRN‐T細胞受體轉基因小鼠與NOD小鼠雜交F1代，在4～5周齡自發產生嚴重的關節炎，將K/B×N小鼠血清注射到正常小鼠如BALB/c、C57BL/6小鼠體內，可在較短時間內誘發關節炎［7］。因此，本研究采用K/B×N小鼠血清轉移性關節炎模型研究TSCS治療RA的作用機制。

研究發現MC與多種自身免疫性疾病的發生聯系密切［8‐9］。RIVELLESE等［10］分析MC在治療早期RA患者滑膜中的存在以及其與滑膜炎組織學特征的關聯和功能關系發現，早期RA患者滑膜MC數較高，且與局部和全身炎癥、自身抗體陽性率和較高的疾病活動度有關，提示MC參與RA發病過程。研究發現，MC通過自身抗體IgG/FcγR介導的活化可產生大量炎癥因子，如IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2、組胺和Tryptase等，且以脫顆粒方式釋放到細胞外，進而導致關節炎［11］。Tryptase是MC的特異性標志物，在胞內含量最多，其在MC中的儲存和表達具有高度選擇性，可作為MC激活及脫顆粒的標志物［12］。

滑膜組織的主要組成細胞是成纖維樣滑膜細胞（fibroblast‐like synoviocytes，FLS），FLS凋亡減少與RA滑膜增生密切相關［13］。體外實驗發現，FLS對Fas凋亡途徑高度敏感［14］。盡管凋亡因子Fas在RA滑膜組織中高表達，FLS仍然高度增殖，提示RA滑膜組織中存在抑制FLS凋亡的機制［15］。研究發現，MC脫顆粒釋放的Tryptase在抑制FLS凋亡的過程中發揮重要調控作用，Tryptase通過與表達于FLS細胞膜上的PAR‐2相互作用，激活PAR‐2偶聯的G蛋白Rho信號轉導途徑抑制FLS凋亡［16‐17］。同時，FLS釋放干細胞生長因子（stem cell factor，SCF），通過與表達在MC上的SCF受體C‐kit結合，維持MC增殖活化，共同構成MC‐FLS雙信號自身放大系統，促進RA發生發展［18］。因此，MC的持續活化可能是抑制RA成纖維樣滑膜細胞凋亡、促進其增殖、引起關節破壞的關鍵，提示抑制MC活化有望成為RA治療的途徑［19］。

課題組前期體外實驗發現，TSCS可顯著抑制不同抗原刺激的MC活化脫顆粒［20］。Tryptase可通過與表達在FLS胞膜上的PAR‐2相互作用，進而激活PAR‐2偶聯的G蛋白Rho信號，抑制FLS凋亡，給予PAR‐2拮抗劑處理后可顯著降低Tryptase對FLS的抗凋亡作用［16］。

本研究采用MC C‐kit基因正常型C57BL/6小鼠和MC C‐kit基因缺陷型KitW‐4Bao小鼠以及過繼移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠進行體內實驗，探究TSCS對K/B×N小鼠血清轉移性關節炎的治療作用，結果表明，MC參與K/B×N小鼠血清轉移性關節炎發病過程，TSCS可明顯降低關節炎小鼠關節腫脹度、關節炎評分、病理學評分、滑膜組織MC脫顆粒率、滑膜組織Tryptase和PAR‐2蛋白和mRNA、IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2、血清IgG表達，對K/B×N小鼠血清轉移性關節炎具有治療作用，其機制可能與TSCS抑制MC活化脫顆粒釋放Tryptase，進而影響MC‐Tryptase‐PAR‐2‐FLS途 徑，抑 制 滑 膜FLS增殖有關，與課題組前期體外實驗結果一致，為以MC為靶點的新型抗RA藥物的研發提供依據。