淫羊藿總黃酮通過抑制小膠質細胞/巨噬細胞介導的氧化應激反應促進髓鞘再生①

韓慶賢 丁智斌李曉慧 宋麗娟王青 柴智 尉杰忠 馬存根

（山西中醫藥大學國家中醫藥管理局多發性硬化益氣活血重點研究室/神經生物學研究中心，太原 030024）

研究表明，氧化應激（oxidative stress，OS）反應參與神經損傷過程，既是其發病機制的關鍵特征，也是重要的病理變化［1］。淫羊藿總黃酮（total flavo-noids of herba epimedii，TFE）是淫羊藿的主要黃酮醇類化合物，具有調節神經內分泌、提高免疫力、抗炎與抗氧化等作用［2］。TFE已被證實是一種有效的抗氧化劑［3］。中樞神經系統（central nervous system，CNS）炎癥性脫髓鞘病是一種累及腦、脊髓和周圍神經的自身免疫性疾病，主要包括多發性硬化癥（mul-tiple sclerosis，MS）、視神經脊髓炎（neuromyelitis op-tica，NMO）和急性播散性腦脊髓炎（acute dissemi-nated encephalomyelitis，ADEM）等，但病因及發病機制尚未闡明，臨床尚無有效治療方式［4］。目前研究認為，OS是其主要發病機制之一［5］。OS可產生過多的氧自由基及其他代謝產物，引發細胞脂質、蛋白和線粒體損傷，甚至誘導細胞死亡導致髓鞘脫失，從而導致脫髓鞘癥狀［6］。核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶‐1（nuclear factor erythroid‐2‐related fac-tor 2/heme oxygenase 1，Nrf2/HO‐1）信號通路可抵抗OS損傷，是機體重要的內源性抗氧化體系之一［7］。

雙環己酮草酸二腙（cuprizone，CPZ）可選擇性損傷少突膠質細胞（oligodendrocytes，OLs），在CNS多個區域誘導脫髓鞘，并伴隨小膠質細胞活化。因此，CPZ脫髓鞘模型是研究和開發靶向髓鞘保護與再生藥物的理想動物模型［8］。本研究通過體外與體內研究探討TFE對小膠質細胞/巨噬細胞OS的抑制作用，以及能否通過抑制OS緩解脫髓鞘，促進髓鞘再生。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與動物BV2細胞株傳自本實驗室；18只成年C57BL/6雄性小鼠（10～12周齡）由北京維通利華實驗動物有限公司提供，實驗開始前于山西中醫藥大學清潔級動物實驗室適應性喂養1周。

1.1.2 試劑與儀器含0.2%CPZ的飼料（美國Sig-ma‐Aldrich公司）；DPPH（德國Sigma‐Aldrich公司）；各檢測試劑盒（南京建城生物工程公司）；anti‐Iba‐1、anti‐Nrf2、anti‐HO‐1（美國Abcam）；anti‐CNPs（德國Millipore）；激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯）。

1.2 方法

1.2.1 原代小膠質細胞制備取新生C57BL/6小鼠（72 h內），75%乙醇消毒，無菌條件下斷頭，剪開頭皮及顱骨，取腦組織，高糖DMEM基礎培養基中（下置冰袋）培養；無菌剝離腦組織，除去小腦、海馬、大腦髓質，分離大腦皮層，剝離腦膜及血管；剪成1～3 mm組織塊，10 000 r/min離心10 min，離心3次，將細胞鋪于75 cm2培養瓶，5% CO2、37℃培養14～16 d，搖床上輕搖6 h，脫離小膠質細胞，1 500 r/min離心10 min，獲取原代小膠質細胞，接種于24孔板，5%CO2、37℃培養。

1.2.2 骨髓來源巨噬細胞（bone marrow‐derived macrophages，BMDMs）制備取成熟C57BL/6小鼠處死，75%乙醇消毒，超凈臺內取其股骨骨髓內細胞1 500 r/min離心7 min，紅細胞裂解液裂解，培養液重懸，均勻接種于10 cm培養皿，加入100 ng/ml M‐CSF誘導骨髓細胞向單核巨噬細胞分化，5%CO2、37℃培養7 d。

1.2.3 分組與給藥BV2細胞、小膠質細胞及BM-DMs隨機分為正常對照組、LPS組及LPS+TFE組。TFE（15 μg/ml）預處理2 h后給予LPS（1 μg/ml）刺激24 h。18只小鼠按平均體重隨機分為正常組、模型組及TFE治療組，每組6只。模型組和TFE治療組用含0.2%CPZ的飼料喂養6周誘導脫髓鞘模型，正常組給予正常飼料，每天記錄體重和食物消耗。造模第4周末（第28天）TFE治療組小鼠腹腔注射TFE 50 mg/（kg·d），200 μl/只，直到第6周末，正常組和模型組每天給予等量生理鹽水。

1.2.4 組織制備10%水合氯醛麻醉小鼠，生理鹽水經心臟灌注，4%多聚甲醛固定，提取腦組織，脫水，OCT包埋，低溫切片機切片，用于免疫熒光染色。

1.2.5 DPPH、ABTS和FRAP法檢測自由基清除能力DPPH實驗：通過光譜光度計對DPPH的紫色甲醇溶液進行漂白，確定其抗氧化活性。將30μl不同濃度的TFE溶液加入到270 μl DPPH溶液中（乙醇中最終濃度為0.2 mmol/L），室溫孵育30 min，檢測515 nm處吸光度，計算DPPH清除效果（%）=（1-A抗氧化物質與DPPH反應/A溶劑DPPH）×100%。各樣品獨立重復實驗3次。ABTS實驗：7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶于10 ml無水乙醇，室溫避光12 h，制備ABTS溶液。將30 μl不同濃度的TFE溶液加入至270 μl ABTS無水乙醇溶液中，室溫孵育30 min，檢測734 nm處吸光度，計算ABTS清除效應（%）=（A溶劑ABTS-A抗氧化物質與ABTS反應）/A溶劑ABTS×100%，各樣品獨立重復實驗3次。FRAP實驗：乙酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 3.6）、TPTZ（10 mmol/L）和三氯化鐵（20 mmol/L）制備FRAP試劑，室溫避光孵育8 min。將30 μl不同濃度的TFE溶液加入到270 μl FRAP溶液中，室溫孵育30 min，檢測593 nm處吸光度，計算FRAP清除效果（%）=（A溶劑FRAP-A抗氧化物質與FRAP反應）/A溶劑的FRAP×100%，各樣品獨立重復實驗3次。

1.2.6 氧化和抗氧化指標檢測3 000 r/min離心細胞懸液10 min，取上清。3 000 r/min離心組織勻漿10 min，BCA法定量提取蛋白。按照試劑盒說明書檢測抗氧化指標［如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH‐Px）和過氧化氫酶（CAT）水平］及氧化中間產物［如丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）和一氧化氮（NO）水平］。

1.2.7 免疫熒光染色腦組織切片（10 μm）在室溫中用4%多聚甲醛固定30 min，加入anti‐Iba‐1、anti‐Nrf2、anti‐HO‐1、anti‐CNPs，4℃孵 育 過 夜，PBS洗滌，加入相應二抗室溫1 h，50%甘油封片，激光共聚焦收集圖像，Image‐ProPlus6.0軟件分析結果。

1.2.8 Black GoldⅡ染色4%多聚甲醛固定切片15 min，烘干，ddH2O浸潤2 min，置于泡沫板60℃水浴加熱，滴加提前預熱的Black GoldⅡ染液染色20 min，ddH2O沖洗2次，滴加預熱好的硫代硫酸鈉溶液，60℃水浴孵育10 min，ddH2O浸洗2次，滴加結晶紫室溫染色3 min，ddH2O浸洗。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統計學分析采用GraphPad 8.0軟件進行統計學分析，數據以±s表示，多組間比較采用方差分析（ANOVA），兩兩比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TFE劑量依賴性清除自由基TFE的DPPH自由基清除活性從10.76%上升為76.45%，TFE濃度為1.56～100μg/ml，DPPH的IC50為24.01μg/ml。1.56～100 μg/ml TFE的FRAP自由基清除活性從11.12%上升為66.17%，FRAP的IC50為35.47μg/ml。ABTS自由基清除活性在16.24%～66.82%存在差異，TFE濃度變化范圍為1.56～100μg/ml，ABTS的IC50為30.08 μg/ml。TFE可 清 除DPPH、ABTS和FRAP自由基，且呈劑量依賴性（圖1）。

2.2 TFE對BV2小膠質細胞、原代小膠質細胞、BMDMs OS的影響如圖2所示，與LPS刺激組相比，TFE顯著降低BV2小膠質細胞NO、H2O2水平（P＜0.05），顯著降低原代小膠質細胞NO、H2O2和MDA水平（P＜0.05），上調BV2小膠質細胞、原代小膠質細胞抗氧化酶SOD、CAT和GSH‐Px水平（P＜0.05），BMD-Ms結果與BV2細胞和原代小膠質細胞結果相似。

圖1 TFE劑量依賴性地清除自由基Fig.1 TFE scavenged free radicals in a dose‐dependent manner

2.3 TFE抑制CPZ脫髓鞘模型OS與體外實驗一致，同CPZ喂養的小鼠相比，TFE處理可顯著降低脫髓鞘小鼠腦蛋白中氧化產物NO、H2O2和MDA含量，上調SOD、CAT和GSH‐Px抗氧化產物含量（P＜0.05，圖3）。

2.4 TFE激活Nrf2/HO‐1抗氧化通路Nrf2是一種重要的內源性抗氧化途徑，能增加下游抗氧化酶Ⅱ相酶中的HO‐1表達。Nrf2/HO‐1信號通路在CNS氧化應激中發揮重要作用［9］。為驗證TFE的抗氧化作用是否與Nrf2/HO‐1信號通路有關，用免疫熒光法檢測體外小膠質細胞與腦內Nrf2/HO‐1表達，結果表明，與正常組相比，LPS模型組與CPZ模型組喂Nrf2和HO‐1表達（P＜0.01，圖4），而TFE治療后則顯著增加其表達（分別為P＜0.01，P＜0.001，圖4）。結果表明，TFE可能通過誘導Nrf2/HO‐1信號通路抑制OS。

圖2 TFE對BV2小膠質細胞、原代小膠質細胞、BMDMs OS的影響Fig.2 Effect of TFE on OS of BV2 microglia cells，prima-ry microglia cells and BMDMs

圖3 TFE對CPZ脫髓鞘小鼠OS的影響Fig.3 Effect of TFE on OS in CPZ demyelinating mice

圖4 TFE激活Nrf2/HO‐1抗氧化通路Fig.4 TFE activates Nrf2/HO‐1 antioxidant pathways

圖5 TFE減少胼胝體髓鞘脫失Fig.5 TFE reduces myelin loss in corpus callosum

圖6 TFE促進髓鞘再生Fig.6 TFE promotes myelin regeneration

2.5 TFE緩解胼胝體髓鞘脫失、促進髓鞘再生Black GoldⅡ染色顯示，CPZ模型組小鼠胼胝體部位髓鞘脫失明顯（P＜0.01），TFE治療后，胼胝體部位髓鞘脫失明顯改善（P＜0.01，圖5）。免疫熒光染色結果顯示，與正常小鼠相比，CPZ模型組小鼠腦內胼胝體區CNPase+細胞減少（P＜0.001），TFE干預組明顯增多（P＜0.001，圖6）。提示TFE治療可促進CPZ脫髓鞘小鼠少突膠質細胞分化，促進髓鞘形成與修復。

3 討論

Nrf‐2/HO‐1是細胞內主要的抗氧化通路，CNPase是髓鞘形成相關蛋白，可特異性表達OLs［9‐10］。研究表明，氧化損傷與CNS變性疾病的發病機制相關［11］。LPS可誘導活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，導致氧化/抗氧化失衡和OS，從而導致細胞組織損傷［12］。CNPase+細胞減少提示OLs成熟或髓鞘再生障礙，而CNPase+細胞增多則提示OLs分化與髓鞘形成。本研究首先建立了體外DPPH、ABTS和FRAP測定TFE的氧化活性實驗，結果表明，TFE具有較強的清除DPPH、ABTS和FRAP自由基的能力，且在一定范圍內與其濃度呈正相關。

氧化還原敏感轉錄因子Nrf2在氧化條件下與抑制因子Kelch樣ECH聯合蛋白1分離，并與抗氧化反應元件Pr結合被激活，啟動下游抗氧化基因HO‐1轉錄［13］。研究發現，Nrf‐2和HO‐1在CNS變性疾病中表達降低，而在治療后表達升高，并減輕局部OS［14‐16］。說明Nrf2在OS相關的神經變性疾病中起重要保護作用。本研究發現體外LPS誘導的小膠質細胞/巨噬細胞中氧化標記物NO、H2O2、MDA水平上升，而TFE干預組NO、H2O2、MDA表達降低，抗氧化酶SOD、CAT、GSH‐Px表達上升，并激活Nrf2，提高HO‐1表達，且在CPZ誘導的脫髓鞘小鼠模型中得到了驗證。結果表明，TFE干預組中，Nrf2和HO‐1有顯著的調節作用，支持了TFE具有抗氧化作用的假設。

本研究表明，TFE可抑制小膠質細胞/巨噬細胞介導的OS，減少髓鞘脫失，促進髓鞘再生，可能通過激活抗氧化通路Nrf2/HO‐1發揮作用。