燈盞花素通過TGF‐β1/Smads通路減輕急性心肌梗死大鼠心室重構①

趙博 彭建軍 李廣平 任利輝（首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院心內科，北京 100038）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種嚴重的心臟疾病，分為ST抬高和非ST抬高MI，但兩者治療方法相似［1］。老年AMI患者的相對比例不斷提高，給社會帶來沉重經濟負擔［2‐3］。由于老年AMI患者的特殊性和復雜性，尚無有效治療手段實現心臟康復［4］。心室重構與AMI并發癥密切相關，是導致AMI患者預后不良的重要原因，因此尋找新的方案抑制心室重構可能有助于AMI治療［5］。燈盞花素是從中草藥中分離得到的類黃酮糖苷混合物，可通過抑制炎癥反應或抗氧化應激發揮心肌保護作用［6］。臨床研究顯示，給予AMI患者經皮冠狀動脈介入術后燈盞花素治療有助于改善其心肌功能［7］。此外，MI后，活化的轉化生長因子‐β1（transforming growth factor‐β1，TGF‐β1）可依賴Smads信號通路參與心室重構［8］。本研究通過構建AMI大鼠模型，初步研究燈盞花素對AMI的作用機理，以期為AMI治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級、雌性SD大鼠，8周齡，體重（220±10）g，購自上海劍鈍生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2019‐0027。實驗經我院動物倫理委員會批準，并遵守3R保護原則。

1.1.2 藥品與試劑燈盞花素片購自廣東彼迪藥業有限公司；TGF‐β1通路激活劑（SRI‐011381 hy-drochloride）購自北京百奧萊博科技有限公司；阿司匹林腸溶片購自沈陽奧吉娜藥業有限公司；Masson三色染色（G1340）和HE染色（G1120）染色試劑盒購自北京Solarbio公司；TGF‐β1（ab215715）、Smad2（ab40855）、p‐Smad2（ab188334）、Smad3（ab40854）兔抗大鼠單抗、p‐Smad3（ab51177）、β‐actin（ab8227）兔抗大鼠多抗、山羊抗兔lgG（H+L）二抗（ab6721）購自Abcam公司。

1.1.3 主要儀器M50倒置熒光顯微鏡購自上海萬衡精密儀器有限公司；EVOS M5000細胞成像系統購自美國Thermo Fisher Scientific公司；EK‐1000B型多普勒彩超儀購自江蘇億康電子科技有限公司；BioPac生理儀購自美國BIOPAC公司。

1.2 方法

1.2.1 建模參考文獻［9］建立AMI大鼠模型：采用1%戊巴比安腹腔麻醉大鼠，氣管插管接呼吸機（55次/min，潮氣量3 ml/100 g）和心電圖，對大鼠左側備皮消毒后，剪開左側4肋間皮膚，鈍性開胸以暴露心臟，于前肢下2 mm左右結扎冠狀動脈，觀察到左心室前壁心肌顏色變化和心電圖ST段弓背抬高0.3 mV以上后，迅速將心臟放回胸腔，縫合手術切口，每天腹腔注射青霉素，若大鼠術后24 h存活，則建模成功。

1.2.2 分組及處理大鼠開胸暴露心臟但不結扎作為假手術組（n=11）。AMI造模成功的大鼠分為5組：模型組（n=10）、燈盞花素Ⅰ組（n=11）、燈盞花素Ⅱ組（n=11）、TGF‐β1激活劑組（n=11）和陽性對照組（n=10）。假手術組和模型組每天灌胃給予等量生理鹽水，燈盞花素Ⅰ組、燈盞花素ⅠⅠ組、TGF‐β1激活劑組、陽性對照組每天分別灌胃給予50、200 mg/kg燈盞花素、10 mg/kg TGF‐β1激活劑+200 mg/kg燈盞花素、100 mg/kg阿司匹林腸溶片，建模成功次日開始給藥，1次/d，連續4周［10］。

1.2.3 心臟超聲檢測末次給藥4 h麻醉大鼠，固定大鼠四肢，采用多普勒心臟彩超檢測大鼠心臟左室以下指標：舒張末徑（end‐diastolic dimension，EDd）、收縮末徑（end‐systolic dimension，ESd）、射血分數（ejection fraction，EF）、短軸縮短率（fractional shortening，FS），每組數據測量3次以上，取平均值［9］。

1.2.4 血流動力學指標檢測分離大鼠頸總動脈，插入導管至左心室，采用生理檢測系統記錄左室壓上升最大速率（+dp/dtmax）和左室壓下降最大速率（-dp/dtmax），每組數據測量3次以上，取平均值。

1.2.5 HE染色頸椎脫臼處死大鼠，取出心臟，清洗后分離得左心室，分為2份，一份采用4%多聚甲醛固定，脫水、包埋后制成石蠟切塊；一份保存于-80℃液氮中備用。將保存的石蠟切塊制成4 μm左右切片，脫蠟、脫水，根據試劑盒說明書進行HE染色，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.6 Masson測定實驗取1.2.5石蠟切片，根據Masson染色試劑盒說明書進行染色，隨機選取5個視野，顯微鏡下觀察心肌組織纖維化程度。

1.2.7 Western blot實驗RIPA裂解液裂解各組大鼠心肌組織勻漿上清，BCA試劑盒定量總蛋白。取20 μg蛋白樣品，5% SDS‐PAGE電泳分離，轉膜，5%牛血清蛋白封膜，依次加入TGF‐β1、Smads2、Smads3、p‐Smads2、p‐Smads3、Smads7和β‐actin一抗（1∶1 000），4℃孵育12 h，TBST洗3次，10 min/次，加入二抗（1∶5 000），25℃孵育40 min，曝光顯影，Image J定量分析。

1.3 統計學分析采用SPSS25.0軟件進行統計學分析，計量數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較行單因素方差分析，進一步比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠超聲檢查結果與假手術組相比，模型組大鼠左心室EDd和ESd值顯著升高（P＜0.05），EF和FS值顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，燈盞花素Ⅰ組、燈盞花素Ⅱ組和陽性對照組大鼠左心室EDd和ESd值顯著降低（P＜0.05），EF和FS值顯著升高（P＜0.05）；與燈盞花素II組相比，TGF‐β1激活劑組大鼠左心室EDd和ESd值顯著升高（P＜0.05），EF和FS值顯著降低（P＜0.05），見表1。

2.2 各組大鼠血流動力學指標與假手術組相比，模型組大鼠左心室+dp/dtmax和-dp/dtmax值顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，燈盞花素Ⅰ組、燈盞花素Ⅱ組和陽性對照組大鼠左心室+dp/dtmax和-dp/dtmax值顯著升高（P＜0.05）；與燈盞花素Ⅱ組相比，TGF‐β1激活劑組大鼠左心室+dp/dtmax和-dp/dtmax值顯著降低（P＜0.05），見表2。

2.3 各組大鼠心肌組織病理學變化假手術組大鼠心肌組織形態正常，心肌細胞排列緊密，細胞空隙較小；模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞間隙顯著擴大；燈盞花素Ⅰ組、Ⅱ組和陽性對照組大鼠心肌細胞排列略不規則，細胞間隙明顯比模型組縮小；與燈盞花素Ⅱ組相比，TGF‐β1激活劑組大鼠心肌細胞排列更加不規則，細胞間隙變大，見圖1。

2.4 各組大鼠心肌纖維化情況假手術組大鼠幾乎無藍色膠原沉積變化；模型組大鼠可見明顯間質膠原沉積；與模型組相比，燈盞花素Ⅰ組、Ⅱ組和陽性對照組大鼠心肌組織膠原密度明顯降低，膠原沉積得到顯著改善；與燈盞花素Ⅱ組相比，TGF‐β1激活劑組大鼠膠原沉積增多。

2.5 各組大鼠心肌組織TGF‐β1和Smads蛋白表達與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織TGF‐β 1、Smads2和Smads3蛋白表達顯著升高（P＜0.05），Smads7蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，燈盞花素Ⅰ組、燈盞花素Ⅱ組和陽性對照組大鼠心肌組織TGF‐β1、Smads2和Smads3蛋白表達顯著降低（P＜0.05），Smads7蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與燈盞花素Ⅱ組相比，TGF‐β1激活劑組大鼠心肌組織中TGF‐β1、Smads2和Smads3蛋白表達顯著升高（P＜0.05），Smads7蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖3。

表1 各組大鼠心臟超聲檢查結果比較（±s）Tab.1 Comparison of results of echocardiography in rats in each group（±s）

表1 各組大鼠心臟超聲檢查結果比較（±s）Tab.1 Comparison of results of echocardiography in rats in each group（±s）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05；compared with Breviscapine I group，3）P＜0.05；compared with Breviscapin II group，4）P＜0.05.

圖1 HE染色觀察各組MI大鼠心肌組織病理學變化（×200）Fig.1 Histopathological changes of myocardium in ratswith MI in each group by HE staining（×200）

圖2 Masson染色觀察各組MI大鼠心肌纖維化變化（×200）Fig.2 Changes of myocardial fibrosis in rats with MI in each group by Masson staining（×200）

表2 各組大鼠血流動力學指標比較（±s，mmHg/ms）Tab.2 Comparison of hemodynamic indexes of rats in each group（±s，mmHg/ms）

表2 各組大鼠血流動力學指標比較（±s，mmHg/ms）Tab.2 Comparison of hemodynamic indexes of rats in each group（±s，mmHg/ms）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.05；compared with Model group，2）P＜0.05；compared with Breviscapine I group，3）P＜0.05；compared with Breviscapin II group，4）P＜0.05.

圖3 各 組 大 鼠 心 肌 組 織TGF‐β1、Smads2、Smads3和Smads7蛋白表達Fig.3 Expressions of TGF‐β1，Smads2，Smads3 and Sma‐ds7 proteins in myocardial tissue of rats in each group

3 討論

心室重構可導致心臟功能下降，是AMI后發病率和死亡率的獨立決定因素，嚴重影響患者生命安全［11］。超聲心電圖監測和血流動力指標可量化AMI局部和整體心室重構和心臟功能，故可用于AMI大鼠模型心臟重塑評價［12‐13］。本研究顯示，與對照組相比，模型組大鼠左心室EDd、ESd顯著升高，EF、FS、+dp/dtmax、-dp/dtmax顯著降低，表明AMI大鼠發生心室重構和心臟功能障礙，提示建模成功。

燈盞花屬于菊科植物，首載于《滇南本草》，可活血化瘀、消炎止痛［14］。燈盞花素為燈盞花的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化和抗血管生成等作用［15］。WANG等［16］研究顯示，燈盞花素可用于防治和治療慢性完全閉塞患者血運重建后的左心室重建，恢復患者心肌功能；趙天等［17］發現，燈盞花素可通過改善血流和血液動力學指標改善大鼠動脈粥樣硬化。本研究發現，給予燈盞花素治療后，AMI大鼠心室重構及心臟功能障礙顯著改善，提示燈盞花素可恢復AMI大鼠心臟功能，推測燈盞花素可能通過預防心室重構延緩AMI發展，但具體機制有待進一步研究。

TGF‐β在病理和生理過程中起重要作用，其中TGF‐β1與AMI后心室重構病理機制密切相關［18］。Smads蛋白是絲/蘇氨酸受體的下游信號分子，也是TGF‐β受體中胞內激酶的唯一底物，具有轉錄激活作用［19］。Smads蛋白家族包括受體調節蛋白Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8、Smad19、共同介質蛋白Smads4和抑制性蛋白Smad6、Smad7 3類，其中TGF‐β1可導致Smad2和Smad3磷酸化，抑制Smads7表達參與AMI進展［8］。本研究顯示，與對照組相比，模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞間隙顯著擴大，可見明顯的間質膠原沉積等病變，TGF‐β1、磷酸化的Smads2和Smads3蛋白表達顯著升高，Smads7蛋白表達顯著降低，提示AMI大鼠心臟功能障礙可能與TGF‐β1/Smad2/Smad3/Smads7途徑相關。給予燈盞花素治療后，AMI大鼠心肌組織病變顯著改善，TGF‐β1/Smad2/Smad3信號通路受抑制，Smads7蛋白水平顯著上升，與臨床常用藥物阿司匹林腸溶片治療效果接近，推測燈盞花素可能通過抑制TGF‐β1/Smads信號通路延緩AMI心室重構，發揮心臟保護作用。

LU等［20］發現，TGF‐β1/Smad2/Smad3信號途徑的激活加重了慢性心力衰竭大鼠心室重構、心肌纖維化和膠原沉積等病理變化。本研究聯合采用燈盞花素和TGF‐β1激活劑治療發現，AMI大鼠心肌組織TGF‐β1蛋白表達、Smads2和Smads3磷酸化水平比單獨采用燈盞花素治療時顯著升高，Smads7蛋白表達顯著降低，大鼠心室重構、心肌組織病變程度和心肌纖維化加重，提示TGF‐β1激活劑可逆轉燈盞花素對AMI大鼠心室重構的抑制作用。另有研究證實，抑制TGF‐β1蛋白表達和Smad2蛋白磷酸化可上調AMI大鼠心肌組織Smad7蛋白表達，降低AMI大鼠心肌組織中膠原水平，改善心室重構［21］。因此，推測TGF‐β1/Smads信號通路可能是燈盞花素治療AMI的關鍵靶點。