黃芪甲苷通過mTORC1通路調控IgA腎病大鼠脾淋巴細胞分化①

彭勝男 陶琰心洪婷 楊海燕 黃青（江西中醫藥大學科技學院臨床醫學系，南昌 330004）

IgA腎病（IgA nephropathy，IgAN）又稱Berger病，是最為常見的原發性腎小球疾病。文獻報道，與健康志愿者相比，IgAN患者血清IL‐10水平較高，血清可溶性生長刺激表達基因2蛋白（growth stimulation expressed gene 2 protein，sST2）濃度與IL‐10水平、24 h尿蛋白和血清IgA水平呈正相關［1］。治療后血清sST2水平顯著降低，血清IL‐10水平顯著升高。故推測sST2和IL‐10參與IgAN發病過程。研究發現，IgAN大鼠p70S6K磷酸化水平較對照組顯著上調，雷帕霉素可有效抑制p70S6K磷酸化，低劑量mTOR抑制劑雷帕霉素可抑制IgA沉積，減少蛋白尿、系膜細胞激活及細胞外基質分泌，保護腎功能［2］。故推測Akt/mTOR/p70S6k通路在IgAN中被激活。

依據國際共識對IgAN的定義，IgAN的診斷標準是免疫熒光檢查可見腎小球系膜區出現IgA或以IgA為主的免疫復合物沉積，以此證明造模成功［3］。亞洲地區IgAN發病率高達30%～40%，常會發展為終末期腎臟病［4］。目前IgAN的發病機制尚未明確，研究認為IgAN患者常伴有胃腸道感染或上呼吸道感染，外源性致病抗原穿過黏膜屏障作用于黏膜細胞或B細胞，導致IgA1分子絞鏈區O‐聚糖半乳糖缺失，導致其糖基化異常，異常糖基化的IgA1分子刺激機體產生大量IgG和IgA抗體，在血清中形成IgA1免疫復合物，最后沉積于腎小球系膜區導致腎臟損傷。因此，減少異常IgA1生成是IgAN治療的關鍵靶點。脾臟是機體最大的免疫器官，含有大量B淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。mTOR與B細胞分化密切相關。結節性腦硬化復合物1（tuberous sclerosis complex‐1，TSC1）是mTOR上游的負性調控因子，敲除小鼠B細胞中的TSC1可導致B細胞成熟障礙。Akt激活時其邊緣區B細胞明顯減少，而mTOR抑制劑雷帕霉素可部分緩解邊緣區B細胞減少，證明mTOR與B細胞增殖密切相關［5］。LPS可作為免疫佐劑，破壞肝臟的內皮網狀系統，減少IgA清除。目前，IgAN的治療方式主要有糖皮質激素、抗感染、抗凝、免疫抑制劑、扁桃體摘除術、血漿置換、血管緊張素轉換酶抑制劑等，但效果較差［6］。IgAN患者扁桃體內含有異常糖基化的IgA1，因此臨床常采取扁桃體摘除術治療IgAN，減少異常IgA1產生，減輕免疫炎癥反應，恢復機體免疫平衡。黃芪治療IgAN已有報道，黃芪顆粒聯合厄貝沙坦治療IgAN可有效調節免疫力，減少感染，降低蛋白尿水平，提高臨床療效［7］。黃芪甲苷（astragalosideⅣ，AS）是黃芪的重要藥理成分，具有免疫調節作用，可減少異常IgA生成，抑制免疫炎癥因子產生，減輕炎癥反應。本研究探討AS對IgAN大鼠脾淋巴細胞分化的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物28只清潔級SD大鼠，體重（200±20）g，購自南昌大學醫學實驗動物科學部。

1.1.2 主要試劑AS購自南京澤朗醫藥科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Roche公司；脂多糖（LPS）購自Sigma公司；四氯化碳（CCl4）、蓖麻油購自上海實驗試劑有限公司；RAPA購自上海源葉生物科技公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標記的IgA抗體和IL‐10抗體購自Abcam公司；CD4抗體和p‐p70S6k抗體購自Cell signaling公司；CD8抗體購自Biolegend公司；p‐mTOR抗體購自Thermo Fisher公司；IgG二抗、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模SD大鼠隨機分為4組：對照組、IgAN模型組、RAPA組和AS組，每組7只。采用BSA+LPS+CCl4聯合構建IgAN大鼠模型，第1～6周隔天灌胃給予BSA（400 mg/kg），第6周和第8周末尾靜脈注射LPS（0.05 mg/只），第1～9周每周末皮下注射CCl4（CCl40.1 ml/只+蓖麻油0.5 ml/只）。RAPA組SD大鼠造模第7周灌胃給予RAPA 1 mg/（kg·d），1次/d，連續4周，其余同IgAN組。AS組大鼠建模過程中灌胃給予AS，前6周采用1%AS混懸液配制BSA，其他操作與IgAN組相同，第7周開始灌胃給予AS 50 mg/（kg·d），1次/d，連續4周，對照組除給予等量生理鹽水，其他操作與IgAN組相同。所有大鼠標準喂食，第10周股動脈取血，快速取脾臟和腎臟，脾臟用4%多聚甲醛固定，用于免疫組化和病理觀察。腎皮質在置于冰上，迅速制成冰凍切片，用于免疫熒光觀察。

1.2.2 腎組織免疫熒光觀察取腎皮質制成8μm冰凍切片，丙酮固定10 min，PBS洗3次，5 min/次，加入正常山羊血清，37℃孵育45 min，甩干，勿洗，滴加FITC標記的IgA抗體（1∶100），避光操作，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，5 min/次，晾干，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 脾組織病理觀察取脾臟用4%多聚甲醛固定，脫水，透明，石蠟包埋，切片（5μm），HE染色，光學顯微鏡觀察各組大鼠脾臟病理學變化。

1.2.4 脾CD4+T細胞數和CD8+T細胞數檢測各組切片脫蠟，水化，微波修復抗原，滴加去離子水，再分別滴加CD4和CD8一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，5 min/次，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次，DAB染色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。普通光學顯微鏡高倍鏡觀察，每張切片隨機選取10個視野觀察并拍照，方網測試系統計數，并計算CD4+T細胞和CD8+T細胞數密度。

1.2.5 脾臟ⅠL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k表達切片脫蠟，水化，抗原修復，分別滴加IL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k抗體，4℃孵育過夜，PBS清洗，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，復染，脫水，透明，封片。高倍鏡觀察并拍照。采用Image‐Pro Plus 6.0軟件進行分析，計算各視野陽性染色的積分光密度（IOD）并計算平均值。

1.3 統計學處理采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎ⅠgA沉積對照組大鼠腎小球系膜區未見明顯綠色熒光，IgAN組大鼠腎小球系膜區可見較強綠色熒光，提示造模成功。與IgAN組比，RAPA組和AS組大鼠腎小球系膜區綠色熒光強度減弱（圖1），提示RAPA和AS可減輕IgAN大鼠炎癥反應，減少腎小球系膜區IgA沉積，可能與中性粒細胞和單核細胞有關，此兩類細胞均可高表達IgA可結晶片段受體（FcαR），前者可介導急性炎癥，后者可介導慢性炎癥。

2.2 大鼠脾臟病理學變化對照組大鼠脾組織結構清晰，白髓區內脾小體較小而少，主要為B淋巴細胞，一側以中央動脈為中心，周圍淋巴組織呈鞘狀包繞，主要為T淋巴細胞。與對照組相比，IgAN組大鼠白髓區內脾小體體積增大。數量增多，生發中心更為明顯，小結帽朝向邊緣區，提示B淋巴細胞進一步增殖，一側動脈周圍淋巴鞘增厚，T淋巴細胞數增多，提示IgAN大鼠脾內體液免疫應答和細胞免疫應答均增強。與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠脾小體增大增多和動脈周圍淋巴鞘增厚情況減輕，提示RAPA和AS均可抑制IgAN大鼠脾內免疫應答，減輕免疫炎癥反應（圖2）。

圖1 大鼠腎臟IgA免疫熒光染色（×400）Fig.1 IgA immunofluorescence staining of kidneys of rats（×400）

圖2 大鼠脾臟病理學檢查（×400）Fig.2 Pathological examination of spleen in rats

2.3 大鼠脾臟CD4+T細胞和CD8+T細胞免疫組化檢測與對照組相比，IgAN組大鼠脾內CD4+T細胞數密度增加而CD8+T細胞數密度減少（P＜0.01）。與IgAN組比，RAPA組 和AS組大 鼠 脾內CD4+T細胞數密度均減少而CD8+T細胞數密度增加（P＜0.05）。提示IgAN大鼠脾內輔助性T細胞（Th）增多而抑制性T細胞（Ts）減少，免疫系統過度激活，AS和RAPA均可有效糾正免疫失衡，抑制免疫系統過度激活（表1、圖3）。

表1 大鼠脾臟淋巴細胞數密度（±s，1×104個/μm3）Tab.1 Number density of lymphocytes in spleen of rats（±s，1×104 cell/μm3）

表1 大鼠脾臟淋巴細胞數密度（±s，1×104個/μm3）Tab.1 Number density of lymphocytes in spleen of rats（±s，1×104 cell/μm3）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with IgAN group，2）P＜0.05.

CD8+T 1.01±0.12 0.64±0.131）0.92±0.111）2）0.96±0.251）2）Groups Control IgAN RAPA AS CD4+T 2.20±0.23 7.20±1.901）5.31±1.631）2）4.60±1.571）2）

圖3 大鼠脾臟CD4、CD8 T細胞免疫組化染色（×400）Fig.3 Immunohistochemical staining of CD4，CD8 T cells in spleens of rats（×400）

圖4 大鼠脾臟IL‐10、p‐mTOR、p‐p70S6k免疫組化染色（×400）Fig.4 Immunohistochemical staining of IL‐10，p‐mTOR，p‐p70S6k in spleens of rats（×400）

表2 大鼠脾臟IL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k表達（±s）Tab.2 Expressions of IL‐10，p‐mTOR and p‐p70S6k in spleen of rats（±s）

表2 大鼠脾臟IL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k表達（±s）Tab.2 Expressions of IL‐10，p‐mTOR and p‐p70S6k in spleen of rats（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with IgAN group，2）P＜0.01.

p‐p70S6k（×103）46.69±25.89 65.11±32.431）22.17±11.841）2）40.10±24.062）Groups Control IgAN RAPA AS IL‐10（×103）10.02±4.97 4.94±2.261）6.33±1.771）2）7.10±2.121）2）p‐mTOR（×103）13.06±7.48 19.96±8.031）9.26±2.961）2）8.90±2.711）2）

2.4 大鼠脾臟ⅠL‐10、p‐mTOR和p‐p70S6k免疫組化檢測與對照組相比，IgAN組大鼠脾臟內IL‐10水平下降（P＜0.01），而p‐mTOR和p‐p70S6k水平升高（P＜0.01）。與IgAN組比，RAPA組和AS組大鼠脾臟內IL‐10水平升高（P＜0.01），而p‐mTOR和p‐p70S6k水平下降（P＜0.01）。提示IgAN大鼠脾臟內免疫抑制因子IL‐10分泌減少，p‐mTOR和p‐p70S6k表達上調，mTORC1信號通路被激活。RAPA組和AS組大鼠脾臟內IL‐10分泌增多，且p‐mTOR和p‐p70S6k表達降低，mTORC1信號通路被抑制（圖4、表2）。

3 討論

IgAN是世界最常見的一種原發性腎小球腎炎，主要以腎小球系膜區IgA免疫復合物沉積為病理學特點［8］。本實驗選用BSA+LPS+CCL4三聯法造模，實驗中對照組大鼠腎臟系膜區未見明顯IgA沉積，而IgAN組大鼠腎臟系膜區出現不連續的顆粒狀IgA沉積，提示造模成功。與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠腎小球系膜區綠色熒光不同程度減弱，提示RAPA和AS均可減輕腎小球系膜區IgA沉積。

IgAN是一種自身免疫性疾病，引起IgAN的自身抗原主要是異常糖基化的IgA1，其形成可能與扁桃體炎、上呼吸道和胃腸道感染等黏膜免疫反應有關，在患者血清和腎小球系膜區均可檢測到較高濃度的異常IgA1［9］。IgAN的發生與多種因素相關，如機體免疫失調、黏膜免疫異常、IgA分子結構異常、IgA免疫復合物清除障礙、遺傳因素等，但具體發病機制尚未明確。可以肯定的是，IgA免疫復合物的大量產生和在腎小球系膜區沉積是發病關鍵。抑制過度免疫應答、減少IgA產生和在腎小球系膜區沉積、維持機體免疫平衡是治療IgAN的重要思路。本研究HE染色切片觀察到，與對照組相比，IgAN組大鼠脾臟白髓中脾小體增大增多，生發中心明顯，動脈周圍淋巴鞘增厚，與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠脾小體增大增多和動脈周圍淋巴鞘增厚情況減輕，提示在IgAN發病中，大鼠脾臟內體液免疫應答和細胞免疫應答增強。血液中IgA主要由骨髓中的漿細胞產生，分泌型IgA主要是由胃腸道和呼吸道黏膜免疫系統產生。本研究考慮IgA主要由B細胞激活后分泌，而脾臟是B細胞的主要定居地及免疫應答的主要場所，結合病理觀察實驗結果，與對照組相比，IgAN組大鼠脾臟白髓中脾小體增大增多，生發中心明顯（脾小體內主要為B細胞），推測IgAN中大量產生的IgA與脾臟B細胞增殖有關，RAPA和AS可抑制免疫激活，減輕免疫應答。

調節性B細胞（regulatory B cells，Breg）在2006年首次被發現，是B細胞的亞群，主要通過分泌IL‐10及TGF‐β等免疫抑制因子發揮免疫調節作用［10］。分泌IL‐10的Breg是目前研究熱點，其可抑制小鼠過敏反應和部分自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡、炎癥性腸病、接觸性過敏反應、哮喘、自身免疫性腦脊髓炎等［11］。本研究顯示，與對照組相比，IgAN組大鼠脾內IL‐10分泌減少，與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠脾內IL‐10分泌增多，提示免疫抑制因子IL‐10分泌減少，免疫應答過度激活，可能是引起IgAN發病的重要原因，分泌IL‐10的調節性淋巴細胞是IgAN發病的關鍵。RAPA和AS可促進IL‐10分泌，抑制過度免疫應答，可能是導致其腎小球系膜區IgA沉積減少的原因之一。同時，本研究顯示，與對照組相比，IgAN組大鼠脾內CD4+T細胞增加而CD8+T細胞減少，與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠脾內CD4+T細胞減少而CD8+T細胞增加，提示在IgAN大鼠脾內Th增多而Ts減少，發生免疫系統過度激活，AS和RAPA均可有效糾正這種免疫失衡，抑制免疫系統過度激活，進一步說明調節性淋巴細胞對IgAN發病起重要作用。

文獻報道，mTOR（雷帕霉素靶蛋白）在炎癥性自身免疫性疾病中發揮重要作用，在IgAN中的作用前言中也有報道［12］。mTOR信號通路對調節Breg、T細胞、單核細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞分化具有重要作用，mTOR分為mTOR復合物1（mTORC1）和mTOR復合物2（mTORC2）2種，mTORC1對RAPA及其衍生物敏感，雷帕霉素可抑制淋巴細胞增殖，mTOR與淋巴細胞分化成熟密切相關［13‐15］。ZHANG等［16］構建了含有mTOR亞等位基因的小鼠模型，下調mTORC1和mTORC2活性及mTOR蛋白表達，小鼠前體B細胞早期發育被部分阻斷，外周B淋巴細胞數明顯減少。在B細胞受體（BCR）介導的B細胞激活中，無論是RAPA還是磷脂酰肌醇‐3‐激酶（PI3K）抑制劑均可阻斷B淋巴細胞增殖，提示PI3K及下游mTOR直接影響BCR通路［17］。mTORC1信號被激活后，作用于轉錄因子核糖體蛋白激酶（p70S6k）和4E‐結合蛋白1（4E‐BP1），其磷酸化程度是反映mTORC1活性的重要指標，在下游蛋白翻譯過程中起關鍵作用。p70S6k被mTORC1激活后可促進mRNA翻譯。本研究顯示，IgAN大鼠脾內p‐mTOR和p‐p70S6k表達上升，與IgAN組相比，RAPA組和AS組大鼠脾內p‐mTOR和p‐p70S6k表達降低，提示在IgAN發病過程中，mTORC1信號通路被激活，而RAPA和AS可抑制mTORC1信號通路激活。基于對BCR增殖作用的影響，抑制mTORC1通路、調節淋巴細胞增殖和分化、抑制免疫炎癥反應有望成為自身免疫性疾病治療的有效方法。

AS是從中藥黃芪中提取的中藥單體，是黃芪的主要藥理成分之一，可減少MCP‐1、TNF‐α和TGF‐β等炎癥細胞因子分泌，減輕免疫炎癥反應。利用免疫抑制劑治療IgAN已取得一定療效［18］。課題組前期研究發現，AS可有效地減少IgAN大鼠脾臟CD20+B細胞數，具體途徑可能是AS通過抑制促炎癥因子高遷移率族蛋白1（high mobility group pro-tein 1，HMFB1）抑制炎癥反應，而HMFB1可通過調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）影響B細胞分化和增殖，糾正免疫失衡。本研究顯示，與IgAN組相比，AS組大鼠脾內p‐mTOR和p‐p70S6k表達降低，mTORC1信號通路被抑制。RAPA可抑制B淋巴細胞增殖，mTOR與B淋巴細胞的分化成熟密切相關，推測AS可能通過抑制mTORC1通路減少脾臟內效應性B細胞數，從而減少IgA產生，減輕免疫炎癥反應。

綜上所述，AS可減輕IgAN大鼠腎小球系膜區IgA沉積，可能與抑制mTORC1信號通路，調節脾臟內淋巴細胞分化和增殖有關，是否有其他信號通路參與有待進一步研究。