基于能量代謝系統評價延胡索乙素對人肝癌細胞的影響①

尹遜哲 劉作家 郭焱（長春中醫藥大學，長春 130117）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發性肝癌的主要類型。HCC已成為全球第六大常見癌癥和第四大癌癥死亡原因，世界衛生組織預計到2030年，全球將有超過一百萬人因HCC死亡［1］。雖然目前臨床的化療、放療等治療方法對HCC患者的治療效果顯著，但患者的5年生存率僅在14.1%左右［2］。由于HCC死亡率高、預后差，開發更有效的治療策略和藥物是當務之急。延胡索乙素（tetra-hydropalmatine，THP）又稱四氫巴馬汀，是罌粟科紫堇屬植物延胡索的一種生物堿（屬于原小檗堿類生物堿），是中藥材延胡索的主要有效成分，目前廣泛應用于醫學和藥理學［3‐4］。線粒體是機體能量代謝、物質合成及信號轉導的細胞器，為多數真核細胞提供氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）產生的ATP［5］。與正常細胞主要依賴于OXPHOS不同，腫瘤細胞增殖不僅需要重要介質——線粒體，還依賴有氧糖酵解，糖酵解的增加為腫瘤細胞快速增殖提供“合成材料”［6］。因此，了解腫瘤發生過程中藥物治療線粒體的機制將是下一代癌癥治療的關鍵。目前，延胡索乙素對人HCC SMMC‐7721細胞的能量代謝作用尚未闡明。本實驗通過THP調控SMMC‐7721細胞能量代謝影響OXPHOS和糖酵解的能量代謝表型，實現THP對腫瘤細胞增殖的抑制作用，以期為HCC的治療與基礎研究提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料延胡索乙素購自北京索萊寶生物公司；人HCC細胞株SMMC‐7721購自中國科學院上海細胞庫；RPMI1640培養液、胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK‐8細胞活力試劑盒購自日本同仁公司；Seahorse XFp體外細胞能量代謝分析系統、細胞線粒體壓力測試試劑盒、糖酵解壓力測試試劑盒、Cali-brant校準液、細胞微孔培養板及探針板購自美國Agilent公 司；FITC偶 聯Annexin‐V凋 亡 試 劑 盒、PI/RNase染色溶液購自美國BD公司；抗caspase‐3抗體、抗caspase‐9抗體和抗cytochromec抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK‐8法檢測THP對SMMC‐7721細胞增殖的影響將處于對數生長期的人HCC細胞SMMC‐7721以5×103個/孔培養于96孔板（100μl/孔），于37℃、5%CO2培養箱中培養過夜，然后分別以0、50、100、150、200、250、300μg/ml THP作用SMMC‐7721細胞，每組設置3個復孔，對照組采用DMSO處理（終濃度0.1%），同法處理以下對照組細胞。37℃、5%CO2培養箱中分別培養24、48和72 h，作用時間到達后，每孔加入10μl CCK‐8溶液，37℃、5%CO2培養箱避光孵育30 min。酶標儀檢測450 nm波長下吸光度（OD），按照公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率（%）=（OD對照孔-OD藥物孔）/OD對照孔×100%。

1.2.2 Seahorse法檢測THP對SMMC‐7721細胞能量代謝的影響選擇處于對數生長期的SMMC‐7721細胞制備細胞懸液，10% RPMI1640培養基將細胞稀釋至5×103個/孔，以5×103個/孔向細胞微孔培養板中加入細胞稀釋液50 μl，置于37℃、5%CO2培養箱中培養12～24 h；THP作用SMMC‐7721細胞24 h，進行線粒體有氧呼吸壓力測試實驗：將2.5 mol/L葡糖糖、0.2 mol/L谷氨酰胺、0.1 mol/L丙酮酸鈉加入不含血清和碳酸氫鹽的細胞培養基，調整pH，代謝調節藥物配置為1 μmol/L寡霉素、1 μmol/L FCCP和0.5 μmol/L魚藤酮，寡霉素添加至第1個藥物注射槽，FCCP加入第2個藥物注射槽，魚藤酮加入第3個藥物注射槽，選擇線粒體呼吸程序分析；糖酵解壓力測試實驗：將10 mmol/L葡糖糖加入至不含血清和碳酸氫鹽的細胞培養基，調整pH，代謝調節藥物配置為寡霉素10 μmol/L、2‐DG 50 mmol/L，寡霉素添加至第1個藥物注射槽，2‐DG加入第2個藥物注射槽，選擇糖酵解程序分析。

1.2.3 流式細胞術檢測THP對人HCC SMMC‐7721細胞凋亡的影響制備SMMC‐7721單層細胞懸液，培養于6孔板，細胞密度為2×105個/孔，于37℃、5% CO2培養箱中培養過夜，以THP（150 μg/ml）作用SMMC‐7721細胞24 h。FITC偶聯Annexin‐V凋亡試劑盒染色SMMC‐7721細胞，細胞通過C6流式細胞儀上樣檢測，分析細胞凋亡率。

1.2.4 流式細胞術檢測THP對人HCC SMMC‐7721細胞周期的影響于6孔板制備單層SMMC‐7721細胞（2×105個/孔），37℃、5% CO2培養箱中培養12～24 h，THP（150 μg/ml）作 用SMMC‐7721細 胞24 h。到達作用時間后，將細胞懸液收集至15 ml離心管，PBS清洗細胞、離心、棄上清；逐滴加入預冷的乙醇，旋渦振蕩細胞，4℃避光過夜；取出后離心、棄上清，PBS清洗后，PI/RNase染色液重懸細胞，轉移至流式管，上機檢測細胞周期情況。

1.2.5 Western blot檢 測THP作用SMMC‐7721細胞后凋亡相關蛋白表達水平制備SMMC‐7721單層細胞培養至6孔板，細胞密度為2×105個/孔，于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，THP（150μg/ml）作用SMMC‐7721細胞24 h。到達作用時間后，收集細胞，提取細胞蛋白質，BCA法測定蛋白質濃度并定量。每孔加20～30 μg蛋白樣品，行SDS‐PAGE電泳，電轉至PVDF膜，5%脫脂乳室溫封閉，一抗孵育過夜。TBST充分洗膜后，室溫下結合山羊抗鼠IgG，TBST充分洗膜、曝光、顯影。ImageJ軟件進行灰度值分析，計算蛋白相對表達量。

1.3 統計學處理采用GraphPad Prism 7.04統計軟件，計量數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THP抑制SMMC‐7721細胞增殖CCK‐8檢測結果表明，THP呈劑量依賴性抑制SMMC‐7721細胞增殖（圖1）；隨著作用時間延長，THP（150μg/ml）對SMMC‐7721細胞的抑制率明顯增加，且具有時間效應關系（圖2）。THP（150 μg/ml）對SMMC‐7721細胞的抑制率在72 h達到（43.30±3.96）%。提示THP可抑制SMMC‐7721細胞增殖。

圖1 THP對人HCC細胞SMMC‐7721活性的影響Fig.1 Effect of activity of human HCC SMMC‐7721 cells treatment with THP

圖2 THP對SMMC‐7721細胞的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of THP on SMMC‐7721 cells

2.2 THP抑制SMMC‐7721細胞的線粒體呼吸和糖酵解在SMMC‐7721細胞中，與對照組相比，THP（150 μg/ml）作用24 h后線粒體基礎呼吸［（54.62±5.03）vs（77.47±6.18）pmoles/min，P＜0.05］、ATP產量［（41.82±2.04）vs（61.16±3.74）pmoles/min，P＜0.05］和 最 大 呼 吸［（100.07±8.47）vs（132.00±16.77）pmoles/min，P＜0.01］顯著均降低（圖3、4），表明THP參與調控線粒體能量代謝，并降低細胞OX-PHOS水平。Seahorse XFp檢測結果表明，與對照組相 比，THP抑 制SMMC‐7721細 胞 的 糖 酵 解 水 平［（26.90±4.98）vs（37.13±2.14）pmoles/min，P＜0.05］、糖酵解能力［（75.93±1.34）vs（85.94±5.45）pmoles/min，P＜0.05］和糖酵解潛能［（43.30±4.46）vs（54.85±1.21）pmoles/min，P＜0.05］，損害SMMC‐7721細胞的有氧糖酵解途徑（圖5、6）。

圖3 THP對SMMC‐7721細胞線粒體呼吸的影響Fig.3 Effects of THP on mitochondrial respiration in SMMC‐7721 cells

圖4 THP對SMMC‐7721細胞基礎呼吸、ATP產量和最大呼吸的影響Fig.4 Effects of THP on basal respiration，ATP produc-tion and maximal respiration in SMMC‐7721 cells

圖5 THP對SMMC‐7721細胞糖酵解的影響Fig.5 Effects of THP on glycolysis in SMMC‐7721 cells

圖6 THP對SMMC‐7721細胞糖酵解水平、糖酵解能力和糖酵解潛能的影響Fig.6 Effects of THP on glycolysis，glycolysis capacity and glycolysis reserve in SMMC‐7721 cells

圖7 THP對SMMC‐7721細胞凋亡的影響Fig.7 Effects of THP on apoptosis of SMMC‐7721 cells

圖8 THP對SMMC‐7721細胞周期G1期的影響Fig.8 Effect of ATV on G1 phase of SMMC‐7721 cells

圖9 THP對SMMC‐7721細胞caspase‐3、caspase‐9和cy-tochrome c蛋白表達的影響Fig.9 Effect of THP on expressions of caspase‐3，cas-pase‐9 and cytochrome c protein in SMMC‐7721 cells

2.3 THP誘導SMMC‐7721細胞凋亡并阻滯細胞周期Annexin V‐FITC染色FCM檢測結果顯示，與對照組相比，THP（150 μg/ml）作用SMMC‐7721細胞24 h后可夠誘導HCC細胞SMMC‐7721凋亡，凋亡率為（25.8±2.8）%（圖7）；PI/RNase流式細胞術結果顯示，G1期細胞逐漸增多，G1期延長（59.02±2.5）%，顯著高于對照組，提示THP可阻滯SMMC‐7721細胞G1期，延緩完整的細胞周期，THP引發的凋亡參與細胞周期阻滯反應，進而影響SMMC‐7721細胞增殖（圖8）。

2.4 THP介導SMMC‐7721細胞線粒體途徑凋亡Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，THP（150 μg/ml）作用SMMC‐7721細胞24 h后caspase‐3、caspase‐9和cytochromec表達量均增加。提示THP可誘導SMMC‐7721細胞凋亡，并介導線粒體途徑相關的細胞凋亡（圖9）。

3 討論

在我國癌譜構成中，HCC是我國常見的惡性腫瘤之一，發病率位居第4，死亡率位居2，且呈上升趨勢。國際癌癥研究最新發布的數據顯示，中國HCC的發病及死亡數約占全球HCC總數的50%［7‐8］。盡管目前治療取得了進展，但HCC仍然是最惡性的疾病之一。THP是中藥延胡索的主要有效成分之一，屬于異喹啉類化合物，具有多種生物學活性，如鎮靜、催眠、抗焦慮、鎮痛、抗心律失常、抗潰瘍、抗心肌缺血及抗腫瘤等功效［9］。目前，THP對人HCC細胞SMMC‐7721抑制增殖作用的研究鮮有報道。因此，本研究以THP作用人肝癌細胞SMMC‐7721，探討其對SMMC‐7721細胞抗增殖左右的影響及機制。結果表明，在細胞生物活性方面，藥物作用時間一定條件下，隨著藥物劑量增加，THP對SMMC‐7721細胞抑制率有不同程度地提高，具有劑量效應關系（P＜0.01）；在藥物劑量一定條件下，隨著作用時間延長，THP對SMMC‐7721細胞抑制率顯著升高，具有時間效應關系（P＜0.01）。

癌癥通過改變新陳代謝、腫瘤細胞重編程營養物質獲取和代謝途徑滿足腫瘤細胞的生物合成和氧化還原需求，使腫瘤細胞無限制地增殖成為可能。干預及紊亂腫瘤細胞代謝途徑成為目前抑制腫瘤細胞增殖的新思路。線粒體在細胞中的主要功能是通過產生ATP為細胞代謝和生物合成提供能量，對正常細胞和腫瘤細胞的存活至關重要［10‐11］。科研組采用目前較先進的細胞能量代謝測定手段Seahorse XFp體外能量分析儀，通過免標記固態傳感器同時測量細胞兩條主要的能量代謝通路，即線粒體呼吸和糖酵解。線粒體依賴有氧進行OXPHOS產生ATP，OCR代表線粒體呼吸作用，因此通過檢測細胞的OCR來評估細胞線粒體呼吸；腫瘤細胞在不依賴于氧氣通過糖酵解產生ATP，并同時產生乳酸和質子，通過檢測（extracellular acidification rate，ECAR）觀察糖酵解水平［12］。本研究采用細胞外能量分析系統測量細胞內線粒體呼吸活性，通過氧氣消耗率可展現基礎呼吸、ATP產量及最大呼吸量，最終反映OXPHOS水平。研究表明，THP導致線粒體功能破壞，減少OXPHOS水平，進而阻斷腫瘤細胞增殖所需能量；Seahorse測定了SMMC‐7721細胞的ECAR，表明THP可誘導SMMC‐7721細胞抗有氧糖酵解效應，THP通過降低SMMC‐7721細胞糖酵解功能阻斷腫瘤細胞第二種供能方式——有氧糖酵解。

多數抗腫瘤化合物可能具有復雜的機制，但誘導及調控凋亡的信號通路是最關鍵的。近年報道指出THP可誘導人胃癌細胞、人鼻咽癌細胞凋亡并阻滯細胞周期［13‐15］。本研究流式細胞術結果表明，THP不僅可以誘導SMMC‐7721細胞凋亡，同時還阻滯SMMC‐7721細胞周期，延長G1期，延緩完整的細胞周期進程，印證并完善了THP在抗腫瘤方面的作用。線粒體膜受損可改變線粒體通透性，使△Ψm下降，導致線粒體基質腫脹，釋放促凋亡因子cyto-chromec。cytochromec與caspase‐9結合形成凋亡小體，進而激活凋亡的關鍵執行者caspase‐3，最終導致細胞凋亡［16‐17］。研究發現，caspase作為機體內不活躍的形式酶，在腫瘤細胞面臨氧化應激時，觸發caspase級聯反應，將cytochromec從線粒體釋放到胞質，介導線粒體途徑的細胞凋亡。

綜上，本研究首次證明THP可抑制線粒體OX-PHOS和糖酵解產生，誘導過度氧化應激，從而導致線粒體功能紊亂，這是介導SMMC‐7721細胞線粒體凋亡途徑的潛在機制。以上特點可為腫瘤治療提供新思路和新方式，同時也表明THP具有開發為臨床治療肝癌藥物的潛力。