柚皮素通過ROS/P38‐MAPK信號通路調(diào)控肺癌A549細胞增殖及凋亡①

張悅 姚宇 梁玉靈 王文軍（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，瀘州 646000）

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，是癌癥死亡的首要原因［1］。雖然目前肺癌有多種治療手段，但肺癌的5年總體生存率仍很低，選擇手術(shù)治療、放化療、靶向治療等常規(guī)治療方法的患者預(yù)期生存率依舊差強人意［2］。目前研究表明，由于細胞增殖與凋亡的平衡被擾亂而導(dǎo)致腫瘤的形成，細胞過度增殖的重要原因是細胞凋亡受阻，細胞凋亡在許多疾病的正常發(fā)展和病理過程中起著至關(guān)重要的作用，凋亡的研究對腫瘤的防治有重要意義［3］?？鼓[瘤藥物可通過促進腫瘤細胞凋亡進而抑制腫瘤惡化進展，同時還可影響腫瘤細胞放療敏感性［4］。雖然化療是目前臨床上治療肺癌的常用手段，但因其可產(chǎn)生耐藥性和毒副作用［5］，導(dǎo)致多數(shù)患者無法完成有效的放化療周期，所以應(yīng)致力于研究新的預(yù)防和治療肺癌的天然藥物［6］。研究表明，如紫杉醇等天然藥物對于抗腫瘤的治療有著很好的療效，所以，尋找新型抗腫瘤的天然藥物意義重大［7］。柚皮素是天然柑橘類水果中最豐富的類黃酮之一，具有抑制乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌和前列腺癌細胞生長的能力［8］。但是，目前柚皮素對肺癌細胞增殖及凋亡的相關(guān)研究較少，其調(diào)控機制尚不十分清楚，本研究旨在探討柚皮素對A549細胞增殖及凋亡的影響，闡明其影響的可能機制，為柚皮素在臨床上預(yù)防及治療肺癌提供證據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及試劑A549細胞來源于西南醫(yī)科大學(xué)中心實驗室；柚皮素（貨號HY‐N0100）、p38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑SB203580（SB）（貨號HY‐10256）購自MCE；胎牛血清（FBS）（貨號141215）購自杭州天杭生物科技有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基（貨號SH30022）購自HyClone；總超氧化物歧化酶（T‐SOD）測試盒（羥胺法）（貨號A001‐1‐1）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（TBA法）（貨號A003‐1）購自南京建成；CCK‐8試劑盒（貨號C0038）、Annexin V‐FITC凋亡檢測試劑盒（貨號AO2001‐02P‐G）購自天津三箭生物技術(shù)有限公司；活性氧（ROS）檢測試劑盒（貨 號S0033）購 自Beyotime，GADPH（貨 號ab37168）、Nrf2（貨號#12721）、HO‐1（貨號10701‐0‐AP）、NQO1（貨號ab80588）、P‐P38（貨號#4511）、P38（貨號#8690）、Cleaved capase3（貨號ab49822）購自Abcam；HRP‐Goat anti Rabbit（貨 號AS1107）購 自ASPEN；RIPA總蛋白裂解液（貨號AS1004）、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（貨號AS1086）、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（貨號AS1059）購自ASPEN。

1.1.2 主要儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱購自SHEL LAB，倒置顯微鏡購自O(shè)LYMPUS；酶標(biāo)檢測儀購自Diatek；流式細胞儀購自BD；離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；電泳儀購自北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將A549細胞置于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中，孵育于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，當(dāng)細胞已長滿培養(yǎng)瓶時，將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，用PBS洗滌2次。

1.2.2 CCK‐8法將細胞用胰蛋白酶消化，以10 000個/孔接種于96孔板中，孵育于37℃下CO2（5%）培養(yǎng)箱中24 h以貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分別更換為100μl細胞樣品分別對應(yīng)的含有柚皮素（30、60、90、120μmol/L）的培養(yǎng)基，對照組更換為含溶劑的培養(yǎng)基，在每孔中加入10 μl CCK‐8溶液孵育2 h后使用酶標(biāo)儀測定450 nm光吸收值以測定細胞活力。細胞存活率%=（實驗組-空白組）/（對照組-空白組）×100%。

1.2.3 流式細胞術(shù)取對數(shù)生長期的A549細胞，在6孔板中培養(yǎng)，分別用（0、30、60、90、120μmol/L）柚皮素處理48 h后，再收集各組培養(yǎng)液于流式管中，用PBS洗滌1遍，然后加入胰酶消化細胞后再加入培養(yǎng)基終止消化；再收集各組細胞于上一步的流式管中，300 g離心5 min，棄去上清后加入1 ml PBS重新懸浮細胞，再300 g離心5 min，棄去上清，沉淀用300μl的Binding Buffer重懸，按照試劑盒操作說明檢測細胞凋亡，采用流式細胞儀獲得分析結(jié)果，實驗重復(fù)3次。

細胞分組同上，按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH‐DA，使終濃度為10μmol/L。用PBS洗3遍，加入1 ml稀釋好的DCFH‐DA，37℃孵育20 min，充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH‐DA后，再加入1 ml HG培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察拍照或流式上機以檢測ROS含量。

1.2.4 WST‐8法、TBA法細胞分組同上，用旋渦混勻器充分混勻，置于37℃恒溫水浴40 min，于波長550 nm處，1 cm光徑比色，測各管吸光度值以檢測SOD活性；用旋渦混勻器充分混勻，95℃沸水水浴40 min，取出后流水冷卻，按3 500～4 000 r/min，離心10 min，于波長523 nm處測各管吸光度值以檢測MDA含量，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot法取對數(shù)生長期的A549細胞，分別用（0、30、60、90、120μmol/L）柚皮素以及柚皮素120 μmol/L+SB（10 μmol/L）處理48 h后，收集各組細胞，用細胞總蛋白提取試劑（RIPA）裂解各組細胞提取總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度；將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液，室溫封閉1 h后，除去封閉液，加入用一抗稀釋液稀釋好的一抗4℃過夜，回收已稀釋的一抗，用TBST洗3次，每次5 min加入二抗稀釋液稀釋好的二抗，室溫孵育30 min，用TBST在室溫下?lián)u床上洗4次，每次5 min，然后化學(xué)發(fā)光檢測，使用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理所有資料采用SPSS22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，所得到的數(shù)值以±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD-t法，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CCK‐8法檢測結(jié)果與對照組相比，柚皮素組可抑制A549細胞增殖，且隨濃度增加，增殖抑制作用更明顯（P＜0.05），方差分析顯示5組的存活率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=70.782，P＜0.001），見圖1、表1。

圖1 不同濃度的柚皮素對A549的細胞增殖的影響Fig.1 Effect of Nar at different concentrations on prolif-eration of A549 cells

圖2 不同濃度的柚皮素對A549的細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Nar on apoptosis of A549 cells

2.2 流式細胞儀檢測結(jié)果與對照組相比，隨著柚皮素濃度增加，A549細胞凋亡逐漸增加（P＜0.001），方差分析顯示5組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖2。與對照組相比，不同濃度柚皮素組MFI的表達升高（P＜0.001），且隨柚皮素濃度增加，MFI呈明顯升高趨勢，方差分析顯示5組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=178.220，P＜0.001），見圖3。

表1 不同濃度柚皮素作用下細胞活力的比較（±s，%）Tab.1 Comparison of cell viability under different con-centrations of Nar（±s，%）

表1 不同濃度柚皮素作用下細胞活力的比較（±s，%）Tab.1 Comparison of cell viability under different con-centrations of Nar（±s，%）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with 30μmol/L Nar，2）P=0.010；compared with 60μmol/L Nar，3）P＜0.001；compared with 90μmol/L Nar，4）P=0.001.

Cell viability 100.00±0.000 95.262±0.4781）89.855±0.4981）2）79.402±0.8061）3）70.264±0.7471）4）70.782 Groups Control 30μmol/L Nar 60μmol/L Nar 90μmol/L Nar 120μmol/L Nar F value n 3 3 3 3 3

2.3 WST‐8法、TBA法結(jié)果與對照組相比，不同濃度柚皮素組SOD活性均下降（P＜0.05），且隨柚皮素濃度增加，SOD活性呈明顯下降趨勢，方差分析5組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=76.847，P=0.000），與對照組相比，不同濃度柚皮素組MDA含量均升高（P＜0.05），且隨柚皮素濃度增加，MDA含量呈現(xiàn)明顯升高趨勢，方差分析顯示5組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=50.589，P=0.000），見圖4、5。

2.4 Western blot檢測結(jié)果

2.4.1 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，柚皮素組Nrf2、NQO1和HO‐1表達水平隨著柚皮素濃度（30、60、90、120μmol/L）的增加而顯著降低，方差分析顯示5組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F值分別為55.063、93.609、192.155，P＜0.001），見圖6。

圖4 柚皮素對A549細胞中SOD活性的影響Fig.4 Effect of Nar on SOD acitivity in A549 cells

圖5 柚皮素對A549細胞中MDA含量的影響Fig.5 Effects of Nar on MDA content in A549 cells

2.4.2 與對照組比較，柚皮素組P38 MAPK蛋白的磷酸化水平以及caspase‐3蛋白的活化水平隨著柚皮素濃度（30、60、90、120 μmol/L）的增加而顯著升高，方差分析5組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=108.073，P＜0.001），兩兩比較顯示，與90μmol/L、120μmol/L柚皮素組相比，抑制劑組P38 MAPK蛋白的磷酸化水平和caspase‐3蛋白活化水平降低（P＜0.05），與30μmol/L、60μmol/L柚皮素組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。

圖6 不同濃度的柚皮素對A549細胞中Nrf2、NQO1和HO‐1蛋白表達的影響Fig.6 Effects of Nar of different concentrations on expres-sion of Nrf2，NQO1 and HO‐1 in A549 cells

圖7 不同濃度柚皮素對P‐P38 MAPK蛋白和caspase‐3蛋白表達的影響Fig.7 Effect of Nar in different concentrations on expres-sion of p‐p38 MAPK and caspase‐3 protein

3 討論

柚皮素是黃酮類化合物家族的一員，富含于柑橘類水果和西紅柿，具有多種預(yù)防性治療特性［9］。已有研究表明，柚皮素在體內(nèi)外對細胞有多種有益的作用，如抗病毒、抗癌、抗炎和心臟保護等［10］。最近研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物及其代謝物可發(fā)揮細胞內(nèi)作用，包括直接調(diào)節(jié)細胞信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)反應(yīng)［11］。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素可通過抑制PI3K/AKT通路中PI3K活性、降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）‐31的活性來促進乳腺癌的凋亡，阻斷細胞周期并調(diào)節(jié)AKT及NF‐κB信號通路抑制乳腺癌細胞的增殖［12］。臨床上，隨著柚皮素攝入量的增加，癌癥的總發(fā)病率顯著降低［13］。本研究顯示，柚皮素可呈濃度依賴性的抑制A549細胞增殖，并促使其凋亡。

研究表明，細胞膜脂質(zhì)過氧化是高活性氧引起的主要氧化反應(yīng)之一，導(dǎo)致丙二醛（MDA）的產(chǎn)生，活性氧（ROS）的產(chǎn)生與MDA水平的升高明顯相關(guān)，超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的抗氧化酶，其活性反映了其清除氧自由基的能力［14‐15］；本研究顯示，柚皮素可使A549細胞中SOD活性降低，同時使A549細胞中ROS、MDA的含量升高，且均呈濃度依賴性，因此可能是由于A549細胞對ROS的清除能力下降，進而導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激損傷，這顯示柚皮素促使細胞凋亡的機制可能是氧化應(yīng)激反應(yīng)。ROS負責(zé)JNK和p38通路的激活，從而導(dǎo)致細胞中其他促凋亡分子水平的升高［16］。本研究探討了柚皮素是否可以誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS的生成，并檢測了細胞內(nèi)ROS的水平，結(jié)果顯示，柚皮素可以升高細胞內(nèi)ROS水平，并呈濃度依賴性，并且可促使A549細胞發(fā)生凋亡。

p38絲裂原活化蛋白激酶（P38 MAPK）是哺乳動物的MAPKs之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，可調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等［17‐18］。研究表明，MAPKs可以調(diào)節(jié)Nrf2的激活和HO‐1基因的表達［19］。Nrf2是一種堿性亮氨酸拉鏈基因子集，通過結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（ARE），激活靶基因表達，如HO‐1、NQO1、SOD，在 抗 氧 化 應(yīng) 激 中 起 重 要 作用［20‐21］。HO‐1主要受Nrf2調(diào)控，是由Nrf2向細胞核的轉(zhuǎn)移及其與HO‐1啟動子的相互作用［22］。NQO1可以防止氧化應(yīng)激，通常，NQO1表達較低，然而在氧化應(yīng)激的情況下，細胞保護是通過激活ROS信號通路，導(dǎo)致多種下游因子的上調(diào)，包括NQO1，因此，NQO1是作為系統(tǒng)細胞氧化還原狀態(tài)的重要標(biāo)志［23］。本研究表明，柚皮素可濃度依賴地下調(diào)Nrf2、NQO1和HO‐1蛋白表達水平，這表明柚皮素可能通過P38 MAPK通路誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

ROS可通過激活MAPK激酶和抑制MAPK磷酸酶等多種途徑導(dǎo)致p38 MAPK的持續(xù)活化［24］，例如，研究顯示，紫草素可導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS的積累增加，導(dǎo)致線粒體膜電位損失、氧化損傷以及JNK和P38 MAPK通路的激活，進而導(dǎo)致A549細胞凋亡，呋喃酮可通過ROS介導(dǎo)的JNK和P38 MAPK通路激活，誘 導(dǎo) 結(jié) 直 腸 癌 細 胞 凋 亡［25］。SHIN［26］顯 示，p38 MAPK抑制劑SB可阻斷ROS引發(fā)的A549細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)柚皮素能顯著提高（p）‐p38 MAPK水平，激活p38 MAPK信號通路，活化A549細胞中p38 MAPK和caspase‐3，濃 度 依 賴 地 下 調(diào)Nrf2、NQO1和HO‐1蛋白表達水平，因此，柚皮素可能通過增加磷酸化（p）‐p38 MAPK的表達誘導(dǎo)A549細胞凋亡。此外，SB可抑制該信號通路傳導(dǎo)途徑，顯著降低柚皮素誘導(dǎo)的A549細胞的Nrf2、NQO1和HO‐1表 達 水 平，也 證 明 了Nrf2、NQO1和HO‐1受p38 MAPK信號通路的調(diào)控，提示柚皮素可能通過ROS/p38 MAPK通路誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，本研究探討了柚皮素可對A549細胞產(chǎn)生增殖抑制作用和凋亡促進作用，并呈濃度依賴性，主要作用機制可能與其抑制了SOD的活性，導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS、MDA的含量升高，并下調(diào)相關(guān)蛋白的表達，從而與激活p38 MAPK信號通路相關(guān)。