橙皮素調控miR‐182‐5p對口腔鱗癌BcaCD885細胞遷移和分泌IL‐6、IL‐8的影響

王超 馬旭亮 程瑞卿 張晶晶 楊莉（河北省眼科醫院口腔種植科，邢臺 054001）

口腔鱗癌是常見頭頸部惡性腫瘤，患病人群趨于年輕化，給人類的生命健康帶來巨大危害，雖然近些年關于口腔鱗癌的研究越來越多，但口腔鱗癌患者的生存率卻沒有得到明顯改善［1］。口腔鱗癌的發生除了與癌細胞惡性生長、轉移有關以外，還與腫瘤微環境有關，腫瘤細胞能夠分泌炎癥因子，加快腫瘤進程［2］。橙皮素是一種黃酮類的化合物，在花卉、水果、食品等物質中廣泛存在，具有生物及藥理學活性［3］。橙皮素具有降低膽固醇、改善糖尿病腎病、治療痤瘡、保護神經等功能［4］。有研究發現，橙皮素還具有抗腫瘤功效，體外能夠抑制結直腸癌、食管癌、前列腺癌等腫瘤細胞生長，對腫瘤細胞EMT、遷移和侵襲能力有抑制作用［5‐7］。對舌癌的研究顯示，橙皮素處理后的舌癌細胞增殖能力降低，細胞周期被阻滯［8］。目前尚不明確橙皮素對口腔鱗癌細胞遷移、侵襲、EMT以及分泌IL‐6、IL‐8的作用。miR‐182‐5p是一個與腫瘤有關的小分子RNA，在人體組織中具有多種生物學作用，其在口腔癌中表達上調，能夠誘導腫瘤進展，miR‐182‐5p被認為是腫瘤發生過程中的促進因子［9］。本次實驗探討橙皮素調控miR‐182‐5p對口腔鱗癌細胞遷移、侵襲、EMT以及分泌IL‐6、IL‐8的影響，為橙皮素治療口腔鱗癌的臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料橙皮素購自成都德思特生物技術有限公司；E‐cadherin抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；N‐cadherin抗體購自美國Proteintech；IL‐8含量測定試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；Vi-mentin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；miR‐182‐5p mimics、mimics control購自上海吉瑪制藥技術有限公司；IL‐6含量測定試劑盒購自杭州賽基生物科技有限公司；MMP‐9抗體購自美國GeneTex。

1.2 方法

1.2.1 CCK‐8檢測橙皮素對口腔鱗癌BcaCD885細胞增殖的影響口腔鱗癌BcaCD885細胞接種到96孔板，接種密度為3 000個細胞/孔，置37℃，5%CO2培養箱中培養過夜，將上清溶液棄掉，細胞分成2組，分別為Control組和Hesperidin組，Control組為0μmol/L橙皮素作用組，Hesperidin組又分成4個濃度梯度，分別為20、40、80、160 μmol/L橙皮素作用組，繼續培養24 h。將培養板取出，將孔中的液體吸棄，添加100 μl的細胞培養液和10 μl的CCK‐8溶液，均勻混合，置于37℃培養4 h。將酶標儀波長調整為450 nm，檢測每個孔的OD值。常規方法計算細胞存活率。

1.2.2 Transwell小室檢測橙皮素對BcaCD885細胞遷移和侵襲的影響將Control組和Hesperidin組（40、80、160 μmol/L）BcaCD885細胞懸浮在不含血清的細胞培養液中備用。細胞侵襲實驗前以基質膠濕化小室，步驟如下：將基質膠4℃融化，用不含血清的DMEM稀釋，每孔中加入100μl稀釋后的基質膠，37℃孵育2 h。其余實驗步驟均相同，簡述如下：吸取細胞溶液添加到小室的上室中，每孔200μl，在下室中添加含有10%胎牛血清的細胞培養液500μl。置于37℃，5%CO2培養箱中培養24 h。用棉簽把沒有穿膜的細胞擦掉，用4%的多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色。在顯微鏡下計數細胞穿膜數目。

1.2.3 Western blot檢 測 橙 皮 素 對BcaCD885細 胞中E‐cadherin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白表達的影響分別取培養24 h后的Control組和Hes-peridin組（40、80、160 μmol/L）BcaCD885細胞，用PBS洗滌，添加RIPA溶液（按照1∶100比例添加PMSF），置于冰上反應5 min，快速振蕩10 s，重復該過程5次。4℃，10 000 g離心10 min。吸取上清溶液，分裝備用。按照BCA方法對蛋白濃度進行分析。此次實驗選擇10%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS‐PAGE電泳。在蛋白樣品中添加2×Loading Buffer溶液，放在100℃孵育5 min。每孔中添加40μg的蛋白樣品，首先以70 V的電壓電泳30 min，然后換成100 V繼續電泳1.5 h。將NC膜按照凝膠的大小進行裁剪，以300 mA的恒流轉膜90 min。將NC膜放在5%牛血清白蛋白溶液中，室溫結合2 h。將NC膜放在1∶1 000稀釋后的一抗溶液中，4℃環境中結合過夜。再將NC膜放在1∶4 000稀釋后的二抗溶液中，室溫結合1 h。采用ECL化學發光顯色液進行顯影。Im-age J分析條帶的灰度值，以β‐actin作為內參，分析目的蛋白相對表達變化。

1.2.4 ELⅠSA法檢測橙皮素對BcaCD885細胞分泌ⅠL‐6、ⅠL‐8的影響分別取培養24 h后的Control組和Hesperidin組（40、80、160μmol/L）BcaCD885細胞培養液上清，以ELISA法檢測IL‐6、IL‐8水平，步驟分別參照IL‐6、IL‐8含量測定試劑盒說明書進行。

1.2.5 qRT‐PCR法檢測橙皮素對BcaCD885細胞中miR‐182‐5p表達的影響分別取培養24 h后的Control組 和Hesperidin組（40、80、160 μmol/L）BcaCD885細胞，按照107個細胞中添加1 ml的Trizol試劑分別提取細胞中的總RNA。用滅菌的雙蒸水調節紫外分光光度計的準確性，添加樣品，檢測OD260/OD280的比值（在1.8～2.0之間）。利用PrimeScript RT reagent Kit進行逆轉錄反應，取1 μg的RNA，加 入2 μl的gDNA Eraser Buffer、1 μl的gDNA Eraser，最后添加RNase Free water至10 μl，42℃孵育2 min，4℃孵育5 min，繼續在上述溶液中加入1 μl的PrimeScript RT Enzyme mixⅠ、4 μl的5×PrimeScript Buffer 2、1 μl的RT Primer mix、10 μl的Reaction solution，最后添加RNase Free water至30μl，放在37℃孵育15 min，85℃孵育5 s，4℃備用。以SYBR Premix Ex TaqⅡ進行PCR反應，取2 μl的cDNA，加 入0.5 μl的Reverse primer和Forward primer、5 μl的SYBR Green PCR Master mix，添 加RNase Free water至10 μl，95℃孵育10 s，55℃孵育30 s，72℃孵育30 s。U6為內參，按照2-ΔΔCT法計算miR‐182‐5p的表達水平。miR‐182‐5p F：5′‐GGGT‐TTGGCAATGGTAGAACTCA‐3′，R：5′‐CCAGTGA‐CGGGTCCGAGGT‐3′；U6 F：5′‐CTCGCTTCGAGCG-CACA‐3′，R：5′‐AACGTTTCACGAATTTGCGT‐3′。

1.2.6 細胞轉染及逆轉作用BcaCD885細胞中分別轉染miR‐182‐5p mimics、mimics control（轉染步驟參照轉染試劑Lipofectamine?2000進行），然后用含80 μmol/L橙皮素細胞培養液培養24 h，記為Hes-peridin+miR‐182‐5p和Hesperidin+miR‐NC組，分別測定細胞增殖（步驟參照1.2.1中CCK‐8法）、遷移、侵襲（步驟參照1.2.2中Transwell小室法）和E‐cad-herin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白表達（步驟參照1.2.3中Western blot法）以及細胞分泌IL‐6、IL‐8水平（步驟參照1.2.4中ELISA法）。

1.3 統計學分析用SPSS21.0分析統計實驗數據，以±s表示，兩組數據間比較使用t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 橙皮素對BcaCD885細胞增殖的影響與0 μmol/L橙皮素處理的Control組比較，20 μmol/L橙皮素處理后的BcaCD885細胞存活沒有變化，而40、80、160 μmol/L橙皮素處理后的細胞存活率降低，選擇40、80、160 μmol/L橙皮素進行后續實驗。見表1。

2.2 橙皮素對BcaCD885細胞遷移、侵襲和EMT的影響與0μmol/L橙皮素處理的Control組比較，40、80、160 μmol/L橙皮素處理后的細胞遷移和侵襲數目依次降低，細胞中E‐cadherin蛋白表達水平依次升高，細胞中Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白水平依次降低。橙皮素抑制口腔鱗癌BcaCD885細胞遷移、侵襲和EMT。見圖1和表2。

2.3 橙皮素對BcaCD885細胞分泌ⅠL‐6、ⅠL‐8的影響與0 μmol/L橙皮素處理的Control組比較，40、80、160μmol/L橙皮素處理后的細胞分泌IL‐6、IL‐8依次減少。橙皮素抑制BcaCD885細胞分泌IL‐6、IL‐8。見表3。

2.4 橙皮素對BcaCD885細胞中miR‐182‐5p表達的影響與0μmol/L橙皮素處理的Control組比較，40、80、160μmol/L橙皮素處理后的細胞中miR‐182‐5p水平依次減少。橙皮素下調BcaCD885細胞中miR‐182‐5p的表達水平。見表4。

表1 橙皮素處理后BcaCD885細胞存活率(±s)Tab.1 Survival rate of BcaCD885 cells treated with hes-peretin(±s)

表1 橙皮素處理后BcaCD885細胞存活率(±s)Tab.1 Survival rate of BcaCD885 cells treated with hes-peretin(±s)

Note：Compared with Control，1）P＜0.05.

Groups Survival rate（%）100.00±9.52 96.32±8.21 80.23±6.941）68.52±5.111）50.31±4.281）20.068＜0.001 Control Hesperidin Hesperetin concentra-tion（μmol/L）0 20 40 80 160 F P

圖1 Western blot檢測橙皮素處理后BcaCD885細胞中E‐cadherin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白水平Fig.1 Western blot detection of E‐cadherin，Vimentin，N‐cadherin and MMP‐9 protein levels in BcaCD885 cells treated with hesperetin

表2 橙皮素處理后BcaCD885細胞遷移數目、侵襲數目和E‐cadherin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白水平(±s)Tab.2 Number of migration，invasion and protein levels of E‐cadherin，Vimentin，N‐cadherin and MMP‐9 of CD885 cells after hesperetin treatment(±s)

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with 40μmol/L，2）P＜0.05；compared with 80μmol/L，3）P＜0.05.

Groups Number of migrations Number of invasion E‐cadherin Vimentin N‐cadherin MMP‐9 0.68±0.08 0.50±0.061）0.36±0.031）2）0.24±0.041）2）3）103.200＜0.001 Control Hesperidin Hesperetin concentration（μmol/L）0 40 80 160 F P 186.63±17.45 163.22±14.171）126.89±10.201）2）90.10±8.851）2）3）93.600＜0.001 152.32±13.56 127.41±10.131）88.39±7.551）2）63.11±3.261）2）3）160.641＜0.001 0.23±0.02 0.30±0.031）0.42±0.041）2）0.53±0.041）2）3）140.267＜0.001 0.60±0.06 0.49±0.051）0.35±0.031）2）0.22±0.021）2）3）133.135＜0.001 0.55±0.04 0.38±0.031）0.30±0.021）2）0.20±0.031）2）3）207.395＜0.001

表3 橙皮素處理后BcaCD885細胞分泌IL‐6、IL‐8水平(±s)Tab.3 Levels of IL‐6 and IL‐8 secreted by BcaCD885 cells after hesperetin treatment(±s)

表3 橙皮素處理后BcaCD885細胞分泌IL‐6、IL‐8水平(±s)Tab.3 Levels of IL‐6 and IL‐8 secreted by BcaCD885 cells after hesperetin treatment(±s)

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with 40 μmol/L，2）P＜0.05；Compared with 80μmol/L，3）P＜0.05.

Groups IL‐6（ng/ml）IL‐8（ng/ml）0.56±0.05 0.43±0.031）0.34±0.041）2）0.26±0.031）2）3）101.034＜0.001 Control Hesperidin Hesperetin con-centration（μmol/L）0 40 80 160 F P 0.42±0.05 0.34±0.031）0.27±0.021）2）0.22±0.021）2）3）74.786＜0.001

表4 橙皮素處理后BcaCD885細胞中miR‐182‐5p的水平(±s)Tab.4 Level of miR‐182‐5p BcaCD885 cells after hesper-etin treatment(±s)

表4 橙皮素處理后BcaCD885細胞中miR‐182‐5p的水平(±s)Tab.4 Level of miR‐182‐5p BcaCD885 cells after hesper-etin treatment(±s)

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with 40μmol/L，2）P＜0.05；compared with 80μmol/L，3）P＜0.05.

miR‐182‐5p level 1.00±0.11 0.68±0.051）0.50±0.041）2）0.41±0.031）2）3）142.789＜0.001 Groups Control Hesperidin Hesperetin concentra-tion（μmol/L）0 40 80 160 F P

表5 miR‐182‐5p mimics轉染和橙皮素處理后BcaCD885細胞中miR‐182‐5p水平、細胞存活率、遷移數目、侵襲數目和E‐cadherin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白水平以及細胞分泌的IL‐6、IL‐8水平(±s)Tab.5 miR‐182‐5p level，cell survival rate，migration number，invasion number and E‐cadherin，Vimentin，N‐cadherin，MMP‐9 in BcaCD885 cells after miR‐182‐5p mimics transfection and hesperetin treatment protein level and IL‐6 and IL‐8 levels secreted by cells(±s)

表5 miR‐182‐5p mimics轉染和橙皮素處理后BcaCD885細胞中miR‐182‐5p水平、細胞存活率、遷移數目、侵襲數目和E‐cadherin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白水平以及細胞分泌的IL‐6、IL‐8水平(±s)Tab.5 miR‐182‐5p level，cell survival rate，migration number，invasion number and E‐cadherin，Vimentin，N‐cadherin，MMP‐9 in BcaCD885 cells after miR‐182‐5p mimics transfection and hesperetin treatment protein level and IL‐6 and IL‐8 levels secreted by cells(±s)

Note：Compared with Hesperidin+miR‐NC，1）P＜0.05.

Groups E‐cadherin Vimentin N‐cadherin MMP‐9 Hesperidin+miR‐NC Hesperidin+miR‐182‐5p t P miR‐182‐5p level 1.00±0.12 2.15±0.251）12.441＜0.001 Survival rate（%）100.00±11.63 186.94±17.491）12.418＜0.001 Number of migrations 125.42±11.36 147.20±10.021）4.314＜0.001 Number of invasion 87.96±6.33 114.85±9.621）7.005＜0.001 0.40±0.05 0.29±0.021）6.128＜0.001 0.32±0.02 0.41±0.041）6.037＜0.001 0.31±0.03 0.46±0.051）7.717＜0.001 0.35±0.04 0.51±0.071）5.954＜0.001 IL‐6（ng/ml）0.24±0.03 0.30±0.021）4.992＜0.001 IL‐8（ng/ml）0.32±0.03 0.40±0.041）4.800＜0.001

2.5 上調miR‐182‐5p對橙皮素調控BcaCD885細胞增殖、遷移、侵襲、EMT和分泌ⅠL‐6、ⅠL‐8的影響與Hesperidin+miR‐NC組比較，Hesperidin+miR‐182‐5p組BcaCD885細胞中miR‐182‐5p水平升高，細胞存活率、遷移數目、侵襲數目均升高，細胞中E‐cad-herin蛋白表達水平減少，Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白表達水平升高，細胞分泌的IL‐6、IL‐8增多。見表5和圖2。

圖2 Western blot檢 測BcaCD885細 胞E‐cadherin、Vi-mentin、N‐cadherin和MMP‐9蛋白水平Fig.2 Western blot detection of E‐cadherin，Vimentin，N‐cadherin and MMP‐9 protein level in BcaCD885 cells

3 討論

橙皮素廣泛存在于自然界中的多種物質如水果、花卉，具有抗氧化、消炎、降血壓等功效，對動脈粥樣硬化、肺組織損傷等具有治療作用［10］。有研究顯示，橙皮素具有抗腫瘤作用，對結腸癌細胞遷移和侵襲有抑制作用，橙皮素治療后的宮頸癌細胞EMT水平降低，細胞增殖能力降低［5，11］。在舌癌研究中發現橙皮素能夠體外抑制舌癌細胞增殖，具有抗舌癌作用［8］。本實驗顯示，橙皮素處理后的口腔鱗癌細胞的增殖能力降低，說明橙皮素能夠在體外抑制口腔鱗癌細胞的生長，這與之前的研究結果相一致。

腫瘤的轉移是一個十分復雜的過程，不僅與細胞內多種基因的異常表達調控有關，還與腫瘤微環境有關［12‐13］。腫瘤細胞從原來的位置脫落以后，通過降解細胞外基質，遷移、侵襲至新的組織，形成新的病發灶，腫瘤細胞降解細胞外基質依賴于細胞外基質降解酶，其中基質金屬蛋白酶的作用極為關鍵，MMP‐9屬于基質金屬蛋白酶家族成員之一，其在腫瘤中表達上調，能夠促進腫瘤轉移［14］。EMT是腫瘤發生轉移的早期標志，EMT是指上皮細胞特征逐漸消失而表現出間質細胞特征的過程［15］。Vimen-tin、N‐cadherin是間質細胞標志蛋白，在腫瘤中過度表達；E‐cadherin是上皮細胞標志蛋白，在腫瘤中表達下調；Vimentin、N‐cadherin表達水平升高而E‐cadherin表達水平降低被認為是EMT的標志［16‐17］。腫瘤微環境是近年來的研究熱點，包括眾多細胞因子、免疫因子等，IL‐6、IL‐8是在口腔鱗癌中表達上調的促炎因子，口腔鱗癌細胞分泌IL‐6、IL‐8增多能夠促進癌癥轉移［18‐19］。研究顯示，橙皮素處理后的結腸癌HCT116細胞遷移和侵襲能力降低，細胞中的MMP‐9水平下降［5］。在宮頸癌中亦發現，橙皮素提高腫瘤細胞中E‐cadherin表達水平，抑制細胞EMT［8］。本實驗發現，橙皮素處理后的口腔鱗癌細胞遷移和侵襲數目減少，細胞中Vimentin、N‐cad-herin、MMP‐9蛋白表達水平降低，E‐cadherin蛋白表達水平升高，說明橙皮素抑制口腔鱗癌細胞遷移、侵襲和EMT，這與其他研究結果相符，均說明橙皮素在腫瘤細胞惡性生物學行為中的抑制功效。同時本研究還顯示，橙皮素能通過減少細胞分泌IL‐6、IL‐8而發揮抑制口腔鱗癌轉移的功能。

雖然已經有很多研究發現橙皮素具有抗腫瘤作用，但目前對橙皮素抗腫瘤的作用機制尚不明確。本實驗發現，橙皮素處理后的口腔鱗癌細胞中miR‐182‐5p表達水平降低，橙皮素作用機制可能與miR‐182‐5p有關。miR‐182‐5p定位在人類第7號染色體上，其首次發現于小鼠眼組織，參與視力、聽力的發育，與脂肪肝、腫瘤等病理過程有關［20‐22］。miR‐182‐5p在腫瘤中表達上調，并且參與腫瘤細胞的增殖和轉移過程。在口腔鱗癌中的實驗發現，miR‐182‐5p表達上調能夠促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，反 之，下 調miR‐182‐5p能 抑 制 腫 瘤 細 胞惡 性 表型［9，23］。本實驗顯示，上調miR‐182‐5p能夠逆轉橙皮素對口腔鱗癌細胞增殖、遷移、侵襲、EMT和分泌IL‐6、IL‐8的影響，這說明橙皮素通過下調miR‐182‐5p參與口腔鱗癌進展。

綜上所述，橙皮素通過下調miR‐182‐5p表達而抑制口腔鱗癌細胞增殖、遷移、侵襲、EMT和分泌IL‐6、IL‐8，這為橙皮素治療口腔鱗癌的臨床應用提供了理論資料，為研究橙皮素抗腫瘤分子機制奠定了基礎。本研究尚未分析橙皮素通過何種靶向機制影響口腔鱗癌進展，且沒有在多株口腔鱗癌細胞中進行驗證，我們將在后續實驗中對這部分內容進行探討。